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Para lo 30 mil chilenos que NO debieron morir.

https://jcm.asm.org/content/46/5/1734

https://jcm.asm.org/content/jcm/46/5/1734.full.pdf

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RNase-resistant, noninfectious virus-like particles containing exogenous RNA sequences (armored RNA) are good candidates as RNA controls and standards in RNA virus detection. However, the length of RNA packaged in the virus-like particles with high efficiency is usually less than 500 bases. In this study, we describe a method for producing armored L-RNA. Armored L-RNA is a complex of MS2 bacteriophage coat protein and RNA produced in Escherichia coli by the induction of a two-plasmid coexpression system in which the coat protein and maturase are expressed from one plasmid and the target RNA sequence with modified MS2 stem-loop (pac site) is transcribed from another plasmid. A 3V armored L-RNA of 2,248 bases containing six gene fragments—hepatitis C virus, severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV1, SARS-CoV2, and SARS-CoV3), avian influenza virus matrix gene (M300), and H5N1 avian influenza virus (HA300)—was successfully expressed by the two-plasmid coexpression system and was demonstrated to have all of the characteristics of armored RNA. We evaluated the 3V armored L-RNA as a calibrator for multiple virus assays. We used the WHO International Standard for HCV RNA (NIBSC 96/790) to calibrate the chimeric armored L-RNA, which was diluted by 10-fold serial dilutions to obtain samples containing 106 to 102 copies. In conclusion, the approach we used for armored L-RNA preparation is practical and could reduce the labor and cost of quality control in multiplex RNA virus assays. Furthermore, we can assign the chimeric armored RNA with an international unit for quantitative detection.

Las partículas similares a virus no infecciosas, resistentes a la ARNasa que contienen secuencias de ARN exógenas (ARN blindado) son buenas candidatas como controles y estándares de ARN en la detección de virus ARN. Sin embargo, la longitud del ARN empaquetado en partículas similares a virus con alta eficiencia suele ser inferior a 500 bases. En este estudio, describimos un método para producir L-RNA blindado. El L-ARN blindado es un complejo de proteína de la cubierta del bacteriófago MS2 y ARN producido en Escherichia coli mediante la inducción de un sistema de coexpresión de dos plásmidos en el que la proteína de la cubierta y la maturasa se expresan a partir de un plásmido y la secuencia de ARN diana con el tallo MS2 modificado. loop (sitio pac) se transcribe a partir de otro plásmido. Un L-RNA blindado de 3V de 2248 bases que contiene seis fragmentos de genes: virus de la hepatitis C, coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV1, SARS-CoV2 y SARS-CoV3), gen de la matriz del virus de la influenza aviar (M300) y H5N1 aviar virus de la influenza (HA300): se expresó con éxito mediante el sistema de coexpresión de dos plásmidos y se demostró que tiene todas las características del ARN blindado. Evaluamos el L-RNA blindado de 3V como calibrador para múltiples ensayos de virus. Usamos el Estándar Internacional de la OMS para ARN del VHC (NIBSC 96/790) para calibrar el L-ARN blindado quimérico, que se diluyó mediante diluciones seriadas de 10 veces para obtener muestras que contenían de 106 a 102 copias. En conclusión, el enfoque que usamos para la preparación de L-RNA blindado es práctico y podría reducir la mano de obra y el costo del control de calidad en ensayos de virus de ARN multiplex. Además, podemos asignar al ARN blindado quimérico una unidad internacional para la detección cuantitativa.

Armored RNA is a complex of MS2 bacteriophage coat protein and RNA produced in Escherichia coli by the induction of an expression plasmid that encodes the bacteriophage sequence consisting of the maturase, the coat protein, the pac site, and an exogenous RNA sequence. This method produces recombinant virus-like particles that are noninfectious and contain predefined RNA (2-6, 8, 11, 12, 15, 16, 28). These armored RNAs are RNase resistant by virtue of their encapsulation within an MS2 coat protein, and they have been widely used as controls, standards, or calibrators for the detection of hepatitis C virus (HCV) (11, 12, 28), human immune-deficiency virus (11, 15), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) (3, 11), enterovirus (2, 5), avian influenza virus 5 (4), and West Nile virus (6) using reverse transcription-PCR (RT-PCR), real-time RT-PCR, and branched DNA assays (2-6, 11, 12, 15, 28).

El ARN blindado es un complejo de la proteína de la cubierta del bacteriófago MS2 y el ARN producido en Escherichia coli mediante la inducción de un plásmido de expresión que codifica la secuencia del bacteriófago que consiste en la maturasa, la proteína de la cubierta, el sitio pac y una secuencia de ARN exógena. Este método produce partículas similares a virus recombinantes que no son infecciosas y contienen ARN predefinido (2-6, 8, 11, 12, 15, 16, 28). Estos ARN blindados son resistentes a la ARNasa en virtud de su encapsulación dentro de una proteína de cubierta MS2, y se han utilizado ampliamente como controles, estándares o calibradores para la detección del virus de la hepatitis C (VHC) (11, 12, 28), inmunológico humano -virus de la deficiencia (11, 15), coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) (3, 11), enterovirus (2, 5), virus de la influenza aviar 5 (4) y virus del Nilo Occidental (6) mediante transcripción inversa -PCR (RT-PCR), RT-PCR en tiempo real y ensayos de ADN ramificado (2-6, 11, 12, 15, 28).

The MS2 bacteriophage consists of 180 U of the bacteriophage coat protein that encapsulates the bacteriophage genome (25). The MS2 phage RNA genome comprises a single plus-sense strand encoding 3,569 nucleotides. The genes are organized from the 5′ end as follows: the maturase or A protein, the bacteriophage coat protein, a 75-amino-acid lysis protein, and a replicase subunit. Packaging of the RNA genome by coat protein is initiated by high-specificity binding to a unique site on the RNA, a single stem-loop structure, containing the initiation codon of the gene for the viral replicase. The armored RNA contains approximately 1.7 kb of bacteriophage RNA sequence encoding the maturase, the coat protein, and the pac site. The wild-type MS2 bacteriophage contains an RNA genome of approximately 3.6 kb. In addition, the extensively folded nature of MS2 RNA (22) may make it particularly suitable for uptake into the confines of a small capsid. Thus, theoretically, at most, 1.9 kb of nonbacteriophage RNA sequence might be encapsulated by this method. Practically, the packaging of 500 bases of RNA has been demonstrated to be very efficient; however, packaging of 1- and 1.5-kb amounts of RNA is inefficient (15). Recently, Huang et al. (11) used armored RNA technology to package a 1,200-nucleotide foreign RNA sequence by deleting some disposable sequences between the multiple cloning site and the transcription terminator; however, to date, there have been no reports of armored RNA with sizes greater than 1,200 bp.

El bacteriófago MS2 consta de 180 U de la proteína de la cubierta del bacteriófago que encapsula el genoma del bacteriófago (25). El genoma del ARN del fago de MS2 comprende una única hebra de sentido positivo que codifica 3.569 nucleótidos. Los genes se organizan desde el extremo 5 ‘de la siguiente manera: la proteína maturasa o A, la proteína de la cubierta del bacteriófago, una proteína de lisis de 75 aminoácidos y una subunidad de replicasa. El empaquetamiento del genoma del ARN por la proteína de la cubierta se inicia mediante la unión de alta especificidad a un sitio único en el ARN, una estructura de tallo-bucle único, que contiene el codón de inicio del gen para la replicasa viral. El ARN blindado contiene aproximadamente 1,7 kb de secuencia de ARN de bacteriófago que codifica la maturasa, la proteína de la cubierta y el sitio pac. El bacteriófago MS2 de tipo salvaje contiene un genoma de ARN de aproximadamente 3,6 kb. Además, la naturaleza extensivamente plegada del ARN de MS2 (22) puede hacer que sea particularmente adecuado para la absorción en los confines de una pequeña cápside. Por tanto, teóricamente, como máximo, 1,9 kb de secuencia de ARN no bacteriófago podrían encapsularse mediante este método. En la práctica, se ha demostrado que el envasado de 500 bases de ARN es muy eficaz; sin embargo, el empaquetado de cantidades de ARN de 1 y 1,5 kb es ineficaz (15). Recientemente, Huang et al. (11) utilizaron tecnología de ARN blindado para empaquetar una secuencia de ARN extraño de 1200 nucleótidos eliminando algunas secuencias desechables entre el sitio de clonación múltiple y el terminador de la transcripción; sin embargo, hasta la fecha, no ha habido informes de ARN blindado con tamaños superiores a 1200 bp.

Although most RT-PCR assays do not target RNA sequences longer than 500 bases, there are some advantages if longer target RNA sequences are packaged. For example, the human immunodeficiency virus Quantiplex assay (Chiron Corp.) uses a standard that is approximately 3 kb in length; consequently, it is not possible to produce a single armored RNA standard for this assay using routine armored RNA technology. A further advantage of using armored RNA of several kilobases is that PCR primers for different regions of these genes may be used with a single armored RNA standard. Accordingly, it is not necessary to construct a different armored RNA standard for each PCR primer pair that might be used. With such a standard, different research groups and clinical laboratories could directly compare their quantitative data. In addition, if long RNA sequences were to be packaged, we could produce a single chimeric armored RNA standard and control that could meet the needs of a variety of different viral assays designed to detect different viral genomes. This would in turn simplify and reduce the cost of multivirus detection. Furthermore, if chimeric armored RNA sequences from different RNA viruses contain an HCV 5′ untranslated region (5′UTR), we could easily assign the chimeric armored RNA with an international unit for quantitative detection since an international standard for HCV RNA is available from the National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC) (20, 21).

Aunque la mayoría de los ensayos de RT-PCR no se dirigen a secuencias de ARN de más de 500 bases, existen algunas ventajas si se empaquetan secuencias de ARN objetivo más largas. Por ejemplo, el ensayo Quantiplex del virus de la inmunodeficiencia humana (Chiron Corp.) usa un estándar que tiene aproximadamente 3 kb de longitud; en consecuencia, no es posible producir un solo estándar de ARN blindado para este ensayo utilizando tecnología de ARN blindado de rutina. Una ventaja adicional de usar ARN blindado de varias kilobases es que se pueden usar cebadores de PCR para diferentes regiones de estos genes con un solo estándar de ARN blindado. Por consiguiente, no es necesario construir un estándar de ARN blindado diferente para cada par de cebadores de PCR que pueda usarse. Con tal estándar, diferentes grupos de investigación y laboratorios clínicos podrían comparar directamente sus datos cuantitativos. Además, si se empaquetaran secuencias largas de ARN, podríamos producir un solo estándar y control de ARN blindado quimérico que podría satisfacer las necesidades de una variedad de diferentes ensayos virales diseñados para detectar diferentes genomas virales. Esto, a su vez, simplificaría y reduciría el costo de la detección de virus múltiples. Además, si las secuencias de ARN blindado quimérico de diferentes virus de ARN contienen una región no traducida 5 ′ del VHC (5’UTR), podríamos asignar fácilmente al ARN blindado quimérico una unidad internacional para la detección cuantitativa ya que un estándar internacional para el ARN del VHC está disponible en Instituto Nacional de Estándares y Controles Biológicos (NIBSC) (20, 21).

Although most RT-PCR assays do not target RNA sequences longer than 500 bases, there are some advantages if longer target RNA sequences are packaged. For example, the human immunodeficiency virus Quantiplex assay (Chiron Corp.) uses a standard that is approximately 3 kb in length; consequently, it is not possible to produce a single armored RNA standard for this assay using routine armored RNA technology. A further advantage of using armored RNA of several kilobases is that PCR primers for different regions of these genes may be used with a single armored RNA standard. Accordingly, it is not necessary to construct a different armored RNA standard for each PCR primer pair that might be used. With such a standard, different research groups and clinical laboratories could directly compare their quantitative data. In addition, if long RNA sequences were to be packaged, we could produce a single chimeric armored RNA standard and control that could meet the needs of a variety of different viral assays designed to detect different viral genomes. This would in turn simplify and reduce the cost of multivirus detection. Furthermore, if chimeric armored RNA sequences from different RNA viruses contain an HCV 5′ untranslated region (5′UTR), we could easily assign the chimeric armored RNA with an international unit for quantitative detection since an international standard for HCV RNA is available from the National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC) (20, 21).

Aunque la mayoría de los ensayos de RT-PCR no se dirigen a secuencias de ARN de más de 500 bases, existen algunas ventajas si se empaquetan secuencias de ARN objetivo más largas. Por ejemplo, el ensayo Quantiplex del virus de la inmunodeficiencia humana (Chiron Corp.) usa un estándar que tiene aproximadamente 3 kb de longitud; en consecuencia, no es posible producir un solo estándar de ARN blindado para este ensayo utilizando tecnología de ARN blindado de rutina. Una ventaja adicional de usar ARN blindado de varias kilobases es que se pueden usar cebadores de PCR para diferentes regiones de estos genes con un solo estándar de ARN blindado. Por consiguiente, no es necesario construir un estándar de ARN blindado diferente para cada par de cebadores de PCR que pueda usarse. Con tal estándar, diferentes grupos de investigación y laboratorios clínicos podrían comparar directamente sus datos cuantitativos. Además, si se empaquetaran secuencias largas de ARN, podríamos producir un solo estándar y control de ARN blindado quimérico que podría satisfacer las necesidades de una variedad de diferentes ensayos virales diseñados para detectar diferentes genomas virales. Esto, a su vez, simplificaría y reduciría el costo de la detección de virus múltiples. Además, si las secuencias de ARN blindado quimérico de diferentes virus de ARN contienen una región no traducida 5 ′ del VHC (5’UTR), podríamos asignar fácilmente al ARN blindado quimérico una unidad internacional para la detección cuantitativa ya que un estándar internacional para el ARN del VHC está disponible en Instituto Nacional de Estándares y Controles Biológicos (NIBSC) (20, 21).

MATERIALS AND METHODS

Construction of pET-MC.MS2 maturase and coat protein genes were amplified by using primers S-MC and A-MC (Table 1) from the pMS27 plasmid (kindly provided by D. S. Peabody) containing nucleotides (nt) 81 to 1749 of the MS2 bacteriophage gene (GenBank accession no. V00642). Sense and reverse primers contained BamHI and HindIII restriction sites (underlined), respectively. These primers correspond to nt 81 to 101 and nt 1721 to 1741 of the MS2 phage genome sequence. The 1.7-kb PCR-amplified DNA fragments were gel purified, digested with BamHI and HindIII, and then ligated to a linearized pET28b (Novagen) vector to generate the recombinant plasmid pET-MC. This plasmid was transformed into competent E. coli DH5α cells according to the manufacturer’s instructions. The pET-MC plasmids in positive clones that could replicate in LB agar in the presence of 100 μg of kanamycin ml−1 were isolated by using a Takara MiniBEST plasmid purification kit (TaKaRa). The DNA insert was sequenced with vector-specific primers using an automated fluorescent DNA sequencer (model 3730XL; Applied Biosystems). The resulting sequences were identified by a search of the NCBI databases for homologous sequences using BLAST.

MATERIALES Y MÉTODOS

La construcción de pET-MC.MS2 maturasa y los genes de la proteína de la cubierta se amplificaron utilizando los cebadores S-MC y A-MC (Tabla 1) del plásmido pMS27 (proporcionado amablemente por DS Peabody) que contiene los nucleótidos (nt) 81 a 1749 de la MS2. gen del bacteriófago (nº de acceso de GenBank V00642). Los cebadores de sentido e inverso contenían sitios de restricción BamHI y HindIII (subrayados), respectivamente. Estos cebadores corresponden al nt 81 a 101 y al nt 1721 a 1741 de la secuencia del genoma del fago MS2. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR de 1,7 kb se purificaron en gel, se digirieron con BamHI y HindIII, y luego se ligaron a un vector pET28b linealizado (Novagen) para generar el plásmido pET-MC recombinante. Este plásmido se transformó en células E. coli DH5α competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos pET-MC de los clones positivos que podían replicarse en agar LB en presencia de 100 µg de kanamicina ml-1 se aislaron utilizando un kit de purificación de plásmidos Takara MiniBEST (TaKaRa). El inserto de ADN se secuenció con cebadores específicos de vector utilizando un secuenciador de ADN fluorescente automático (modelo 3730XL; Applied Biosystems). Las secuencias resultantes se identificaron mediante una búsqueda en las bases de datos del NCBI de secuencias homólogas usando BLAST.

Construction of pACYC-3V.An exogenous chimeric sequence 2,248 bp in length comprising the following sequences was inserted into a pACYCDuet-1 plasmid (p15A-type replication origin; Novagen): M-300 (nt 17∼373, 357 bp from avian influenza virus matrix gene; GenBank accession no. DQ864720), SARS-CoV1 (nt 15224 to 15618, 395 bp from SARS-CoV; GenBank accession no. AY864806), SARS-CoV2 (nt 18038 to 18340, 303 bp from SARS-CoV; GenBank accession no. AY864806), SARS-CoV3 (nt 328110 to 28692, 583 bp from SARS-CoV; GenBank accession no. AY864806), a pac site (19 bp), HCV (nt 18 to 310, 293 bp from HCV 5′UTR; GenBank accession no. AF139594), and HA300 (nt 295 to 611, 317 bp from H5N1 avian influenza virus; GenBank accession no. DQ864720). The target sequence included the forward and reverse primer sites, flanking regions, and probe-binding sites previously published or described. A 19-mer pac site was placed between SARS-CoV3 and HCV (Fig. 1). We spliced the six target DNA sequences using overlapping extensions (10). During the first-round PCR, these six small fragments were amplified as follows. SARS-CoV1 was amplified from a pBSSR-V6 plasmid (kindly provided by the Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Institute of Basic Medical Sciences), containing nt 13785 to 16051 of the SARS-CoV gene, using the primers S-SARS1 and LAP-SARS1. SARS-CoV2 was amplified from a pNCCL-SARS plasmid (constructed by our laboratory), containing nt 18038 to 18340 of the SARS-CoV gene, using the primers LAP-SARS2 and A-SARS2. SARS-CoV3 was amplified from a pBSSR7-8 plasmid (kindly provided by the Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Institute of Basic Medical Sciences), containing nt 27730 to 29212 of the SARS-CoV gene, using the primers LAP-SARS3 and A-SARS3. The HCV fragment was amplified from a pNCCL-HCV plasmid (constructed by our laboratory), containing nt 18 to 310 of the HCV gene, using the primers S-HCV and HCV-LAP1(underlined for 19mer pac site). HA300 was amplified from a pNCCL-H5N1 plasmid (constructed by our laboratory) using the primers HA300LAP and A-HA300. M300 was amplified from a pNCCL-H5N1 plasmid (constructed by our laboratory) using the primers M300-S′ and M+SLAP1. The PCR products from the first-round amplifications were gel purified and used, together with outside primers, in the overlap extension PCR. In the second-round PCR, amplified SARS-CoV1 plus SARS-CoV2 and HCV plus HA300 were amplified using the primers pairs S-SARS1-LAP-SARS2+ and FIVELAP2-OverlapA′, respectively. The PCR products from the second round were gel purified. The third-round PCR amplified SARS-CoV1 plus SARS-CoV2 plus SARS-CoV3 using the primers M+SLAP2 and FIVELAP1. The PCR products from the third round were gel purified. The fourth-round PCR amplified SARS-CoV1 plus SARS-CoV2 plus SARS-CoV3 plus HCV plus HA300 using primers M+SLAP2 and OverlapA′. The fifth-round PCR amplified M300 plus SARS-CoV1 plus SARS-CoV2 plus SARS-CoV3 plus HCV plus HA300 using the primers M300-S′ and OverlapA′. Sense and reverse primers contained FseI and PacI restriction sites (underlined in Table 1), respectively. The fifth-round PCR products were gel purified. The purified fragments were cloned into a pGEM-T Easy vector (Promega) and then excised from the resulting recombinant plasmid with the FseI and PacI restriction enzymes. Simultaneously, the pACYCDuet-1 plasmid was digested with FseI and PacI, and the resulting fragments were ligated into the linearized pACYCDuet-1 plasmid to produce a new donor plasmid (pACYC-3V). pACYC-3V plasmids in positive clones, which could replicate on LB agar in the presence of 100 μg of chloramphenicol ml−1, were confirmed by PCR and sequencing.

Construcción de pACYC-3V.Una secuencia quimérica exógena de 2248 pb de longitud que comprende las siguientes secuencias se insertó en un plásmido pACYCDuet-1 (origen de replicación de tipo p15A; Novagen): M-300 (nt 17∼373, 357 pb de influenza aviar gen de la matriz del virus; número de acceso de GenBank DQ864720), SARS-CoV1 (nt 15224 a 15618, 395 pb de SARS-CoV; número de acceso de GenBank AY864806), SARS-CoV2 (nt 18038 a 18340, 303 pb de SARS-CoV; Número de acceso de GenBank AY864806), SARS-CoV3 (nt 328110 a 28692, 583 pb de SARS-CoV; número de acceso de GenBank AY864806), un sitio pac (19 pb), VHC (nt 18 a 310, 293 pb de HCV 5 ‘UTR; número de acceso de GenBank AF139594) y HA300 (nt 295 a 611, 317 pb del virus de la influenza aviar H5N1; número de acceso de GenBank DQ864720). La secuencia diana incluía los sitios del cebador directo e inverso, las regiones flanqueantes y los sitios de unión a la sonda publicados o descritos anteriormente. Se colocó un sitio pac de 19 meros entre el SARS-CoV3 y el VHC (Fig. 1). Empalmamos las seis secuencias de ADN diana utilizando extensiones superpuestas (10). Durante la primera ronda de PCR, estos seis pequeños fragmentos se amplificaron como sigue. El SARS-CoV1 se amplificó a partir de un plásmido pBSSR-V6 (proporcionado amablemente por la Academia China de Ciencias Médicas y el Colegio Médico de la Unión de Pekín, Instituto de Ciencias Médicas Básicas), que contiene nt 13785 a 16051 del gen SARS-CoV, utilizando los cebadores S -SARS1 y LAP-SARS1. El SARS-CoV2 se amplificó a partir de un plásmido pNCCL-SARS (construido por nuestro laboratorio), que contenía nt 18038 a 18340 del gen SARS-CoV, utilizando los cebadores LAP-SARS2 y A-SARS2. El SARS-CoV3 se amplificó a partir de un plásmido pBSSR7-8 (proporcionado amablemente por la Academia China de Ciencias Médicas y el Peking Union Medical College, Instituto de Ciencias Médicas Básicas), que contiene nt 27730 a 29212 del gen SARS-CoV, utilizando los cebadores LAP -SARS3 y A-SARS3. El fragmento de HCV se amplificó a partir de un plásmido pNCCL-HCV (construido por nuestro laboratorio), que contenía entre 18 y 310 nt del gen del HCV, utilizando los cebadores S-HCV y HCV-LAP1 (subrayado para el sitio pac 19mer). HA300 se amplificó a partir de un plásmido pNCCL-H5N1 (construido por nuestro laboratorio) utilizando los cebadores HA300LAP y A-HA300. M300 se amplificó a partir de un plásmido pNCCL-H5N1 (construido por nuestro laboratorio) utilizando los cebadores M300-S ‘y M + SLAP1. Los productos de PCR de las amplificaciones de la primera ronda se purificaron en gel y se usaron, junto con los cebadores externos, en la PCR de extensión por superposición. En la segunda ronda de PCR, se amplificaron SARS-CoV1 más SARS-CoV2 y HCV más HA300 utilizando los pares de cebadores S-SARS1-LAP-SARS2 + y FIVELAP2-OverlapA ‘, respectivamente. Los productos de PCR de la segunda ronda se purificaron en gel. La PCR de tercera ronda amplificó SARS-CoV1 más SARS-CoV2 más SARS-CoV3 utilizando los cebadores M + SLAP2 y FIVELAP1. Los productos de PCR de la tercera ronda se purificaron en gel. La PCR de cuarta ronda amplificó SARS-CoV1 más SARS-CoV2 más SARS-CoV3 más HCV más HA300 utilizando los cebadores M + SLAP2 y OverlapA ′. La PCR de quinta ronda amplificó M300 más SARS-CoV1 más SARS-CoV2 más SARS-CoV3 más HCV más HA300 utilizando los cebadores M300-S ′ y OverlapA ′. Los cebadores de sentido e inverso contenían sitios de restricción FseI y PacI (subrayados en la Tabla 1), respectivamente. Los productos de PCR de la quinta ronda se purificaron en gel. Los fragmentos purificados se clonaron en un vector pGEM-T Easy (Promega) y luego se escindieron del plásmido recombinante resultante con las enzimas de restricción FseI y PacI. Simultáneamente, el plásmido pACYCDuet-1 se digirió con FseI y PacI, y los fragmentos resultantes se ligaron en el plásmido pACYCDuet-1 linealizado para producir un nuevo plásmido donante (pACYC-3V). Los plásmidos pACYC-3V en clones positivos, que podían replicarse en agar LB en presencia de 100 μg de cloranfenicol ml-1, se confirmaron mediante PCR y secuenciación.

Construction of pET-MS2-3V.In order to compare armored RNA particles and armored L-RNA particles, we constructed pET-MS2-3V according to routine armored RNA technology (15). The DNAs encoding the maturase; the coat protein; the pac site; and the exogenous chimeric sequence (1,900 bp) containing SARS-CoV1, SARS-CoV2, SARS-CoV3, HCV, and HA300 were cloned downstream of the inducible T7 promoter of pET28b.

Expression and purification of virus-like particles.Both pET-MC and pACYC-3V plasmids were cotransformed into E. coli strain BL21(DE3). The 3V armored L-RNA was expressed as described previously (16). The cells were harvested by centrifugation and then washed three times with phosphate-buffered saline. The cells were pelleted and then resuspended in 20 ml of sonication buffer (5 mM MgSO4, 0.1 M NaCl, 50 mM Tris [pH 8.0]). The cells were sonicated (Branson Sonifier 350) by using a small sonication probe operating at 50% duty cycle (unit 5 power) for five pulses. The sonicate was placed on ice for 1 min, and then the sonication step was repeated another five times. The sonicate was centrifuged in order to pellet the cell debris. A total of 20 ml of supernatant was then incubated with 1,000 U of E. coli RNase 1 and 200 U of bovine pancreatic DNase 1 at 37°C for 40 min in order to eliminate E. coli RNA and DNA. After nuclease treatment, 5 μl of supernatant was electrophoresed on an agarose gel in TAE buffer and stained with ethidium bromide to assay for armored L-RNA. A CsCl gradient was then performed as the standard method (16). In order to compare the densities of 3V armored L-RNA and 3V armored RNA particles, the 3V armored RNA from pET-MS2-3V was expressed as described previously (16). Each RNA was loaded on separate gradients. After ultracentrifugation, the ultracentrifugation tube was stabilized in an upright position. An 18-gauge needle was slowly inserted into the bottom of the tube, and 0.5-ml fractions were collected and weighed in order to determine the density of the CsCl. The optical density of each fraction at 260 nm was measured in order to quantify the 3V armored L-RNA and 3V armored RNA particles. A 5-μl portion of each fraction was electrophoresed on an agarose gel in TAE buffer and stained with ethidium bromide in order to determine the fractions containing armored L-RNA and those containing armored RNA. The fractions were then pooled and dialyzed against sonication buffer in order to remove CsCl. The dialysate was collected and stored at 4°C.

Construcción de pET-MS2-3V.Para comparar partículas de ARN blindado y partículas de L-RNA blindado, construimos pET-MS2-3V de acuerdo con la tecnología de ARN blindado de rutina (15). Los ADN que codifican la madurasa; la proteína de la capa; el sitio pac; y la secuencia quimérica exógena (1900 pb) que contenía SARS-CoV1, SARS-CoV2, SARS-CoV3, HCV y HA300 se clonaron corriente abajo del promotor inducible T7 de pET28b.

Expresión y purificación de partículas similares a virus. Los plásmidos pET-MC y pACYC-3V se cotransformaron en la cepa de E. coli BL21 (DE3). El L-RNA blindado de 3V se expresó como se describió anteriormente (16). Las células se recolectaron por centrifugación y luego se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato. Las células se sedimentaron y luego se resuspendieron en 20 ml de tampón de sonicación (MgSO4 5 mM, NaCl 0,1 M, Tris 50 mM [pH 8,0]). Las células se sometieron a ultrasonidos (Branson Sonifier 350) utilizando una pequeña sonda de sonicación que funciona al 50% del ciclo de trabajo (unidad 5 de potencia) durante cinco pulsos. El sonicado se colocó en hielo durante 1 minuto y luego se repitió el paso de sonicación otras cinco veces. El sonicado se centrifugó con el fin de sedimentar los restos celulares. A continuación, se incubó un total de 20 ml de sobrenadante con 1.000 U de ARNasa 1 de E. coli y 200 U de ADNasa 1 pancreática bovina a 37 ° C durante 40 min para eliminar el ARN y el ADN de E. coli. Después del tratamiento con nucleasa, se sometieron a electroforesis 5 µl de sobrenadante en un gel de agarosa en tampón TAE y se tiñeron con bromuro de etidio para analizar el L-ARN blindado. A continuación, se realizó un gradiente de CsCl como método estándar (16). Con el fin de comparar las densidades de las partículas de L-RNA blindado de 3V y de las partículas de ARN blindado de 3V, el ARN blindado de 3V de pET-MS2-3V se expresó como se describió anteriormente (16). Cada ARN se cargó en gradientes separados. Después de la ultracentrifugación, el tubo de ultracentrifugación se estabilizó en posición vertical. Se insertó lentamente una aguja de calibre 18 en el fondo del tubo y se recogieron y pesaron fracciones de 0,5 ml para determinar la densidad del CsCl. Se midió la densidad óptica de cada fracción a 260 nm con el fin de cuantificar las partículas de L-RNA blindado de 3V y de ARN blindado de 3V. Una porción de 5 µl de cada fracción se sometió a electroforesis en un gel de agarosa en tampón TAE y se tiñó con bromuro de etidio para determinar las fracciones que contienen L-RNA blindado y aquellas que contienen RNA blindado. A continuación, las fracciones se combinaron y se dializaron frente a tampón de sonicación para eliminar el CsCl. El dializado se recogió y se almacenó a 4 ° C.

RNA extraction.RNA was extracted from 140 μl of the purified armored L-RNA by using a QIAamp viral RNA minikit (Qiagen) according to the manufacturer’s instructions. The extracted RNA was eluted in 60 μl of diethyl pyrocarbonate-treated H2O and then used as a template for RT-PCR and RNA electrophoresis.

Identification of armored L-RNA by RT-PCR.RT of the 3V armored L-RNA was carried out by using the Overlap-A downstream primer; this primer corresponds to nt 581 to 605 of the H5N1 gene. PCR was carried out with the primers M300RT-S and HA300RT-A in order to amplify the full length of the 3V L-RNA. RT-PCR was conducted in separate (two-step) reactions by using an Eppendorf PCR system Autorisierter thermal cycler (Eppendorf). For the RT step, each reaction mixture (20 μl) contained 4 μl of first-strand buffer (Invitrogen), 1 μl of 10 mM deoxynucleoside triphosphates, 1 μl of RNaseOUT, 1 μl of 0.1 mM dithiothreitol, 1 μl of reverse primer (Overlap-A), 1 μl of SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen), 5 μl of RNA, and sterile distilled water to 20 μl. The reaction mixture was incubated initially at 55°C for 50 min and then at 70°C for 15 min. An aliquot (5 μl) of the resulting cDNA was amplified by PCR using a 25-μl mixture that contained 1× PCR buffer (Promega), 1.5 mM MgCl2, 300 μM deoxynucleoside triphosphate, 1.5 μM concentrations of each primer, and 1.25 U of Taq DNA polymerase (Promega). After an initial incubation at 95°C for 3 min, 40 cycles of the following temperature conditions were used: 95°C for 30 s, 56°C for 30 s, and 72°C for 140 s. A final extension at 72°C for 10 min was performed. Several controls, including a negative control with no template, a positive control with DNA from pACYC-3V, and a negative control with supernatant of the virus-like particles without RT, were tested simultaneously. PCR products (5 μl) were analyzed by electrophoresis on agarose gels containing ethidium bromide.

Extracción de ARN: se extrajo ARN de 140 μl del L-ARN blindado purificado utilizando un minikit de ARN viral QIAamp (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN extraído se eluyó en 60 μl de H2O tratada con pirocarbonato de dietilo y luego se usó como molde para RT-PCR y electroforesis de ARN.

Identificación de L-RNA blindado por RT-PCR. La RT del L-RNA blindado de 3V se llevó a cabo utilizando el cebador Overlap-A corriente abajo; este cebador corresponde a nt 581 a 605 del gen H5N1. La PCR se llevó a cabo con los cebadores M300RT-S y HA300RT-A para amplificar la longitud completa del L-RNA de 3V. La RT-PCR se llevó a cabo en reacciones separadas (de dos pasos) utilizando un ciclador térmico Autorisierter del sistema Eppendorf PCR (Eppendorf). Para el paso de RT, cada mezcla de reacción (20 μl) contenía 4 μl de tampón de primera hebra (Invitrogen), 1 μl de desoxinucleósidos trifosfatos 10 mM, 1 μl de RNaseOUT, 1 μl de ditiotreitol 0,1 mM, 1 μl de cebador inverso ( Overlap-A), 1 μl de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen), 5 μl de ARN y agua destilada estéril hasta 20 μl. La mezcla de reacción se incubó inicialmente a 55 ° C durante 50 min y luego a 70 ° C durante 15 min. Se amplificó una alícuota (5 μl) del ADNc resultante mediante PCR utilizando una mezcla de 25 μl que contenía 1 × tampón de PCR (Promega), MgCl2 1,5 mM, trifosfato de desoxinucleósido 300 μM, concentraciones de 1,5 μM de cada cebador y 1,25 U de Taq ADN polimerasa (Promega). Después de una incubación inicial a 95 ° C durante 3 min, se utilizaron 40 ciclos de las siguientes condiciones de temperatura: 95 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 sy 72 ° C durante 140 s. Se realizó una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Se ensayaron simultáneamente varios controles, incluido un control negativo sin molde, un control positivo con ADN de pACYC-3V y un control negativo con sobrenadante de partículas similares a virus sin RT. Los productos de PCR (5 µl) se analizaron por electroforesis en geles de agarosa que contenían bromuro de etidio.

In order to increase the sensitivity of the RT-PCR, a second amplification was performed in a 25-μl reaction mixture containing 5 μl of the amplification product under the same PCR conditions.

The identity of the amplification products was confirmed by agarose gel electrophoresis. The strands of full-length 3V PCR product were cloned into pGEM-T Easy vectors (Promega), and then the recombinant AT clones were sent to Beijing Sunbiotech Co. to be sequenced using T7 and SP6 primers. The sequences obtained were compared to the target sequences.

In order to determine the nature of the RNA packaged into 3V armored RNA, RT of the RNA was carried out with three downstream primers: Overlap-A, HCV-LAP1, and A-SARS3. PCR was carried out with the primers S-SARS1 and HA300RT-A in order to amplify the full length of the 3V RNA and with the primer pairs S-SARS1 and HCV-LAP1, S-SARS1 and A-SARS3, and S-SARS1 and A-SARS2 to amplify the SARS-CoV1+SARS-CoV2+SARS-CoV3+HCV sequence, the SARS-CoV1+SARS-CoV2+SARS-CoV3 sequence, and the SARS-CoV1+SARS-CoV2 sequence, respectively.

Stability of 3V armored L-RNA.The armored L-RNA was examined for stability in newborn calf serum. Initially, the purified 3V armored L-RNA preparation was quantified, in duplicate, with an HCV RNA PCR fluorescence quantitative diagnostic kit (Shanghai Kehua Bio-Engineering Co., Ltd.). The quantified 3V armored L-RNA was serially diluted 10-fold with the newborn calf serum to obtain 10,000 and 1,000,000 copies/ml. For each stability study, a single batch was separated into aliquots in individual time point samples of 100 μl. The samples were then incubated at 4°C, 37°C, or room temperature. 3V armored L-RNA plasma samples were removed at each time point and were stored at −80°C until completion of the experiment. All samples were quantified by using an HCV RNA RT-PCR fluorescence quantitative diagnostic kit (Shanghai Kehua) and LightCycler thermal cycler (Roche). The data were then analyzed by using LightCycler software (Roche).

Calibration of the chimeric armored RNA against an international standard for HCV RNA.Initially, the purified 3V armored L-RNA preparation was quantified, in duplicate, using a HCV RNA PCR fluorescence quantitative diagnostic kit (Shanghai Kehua). The quantified 3V armored L-RNA was diluted with newborn calf serum, and 500-μl aliquots were prepared by 10-fold serial dilution to obtain samples containing 106 to 102 copies/ml.

In order to calibrate the chimeric armored RNA, the National Reference material for HCV RNA (GBW09151, 2.26 × 103 IU ml−1 to 4.22 × 107 IU ml−1) was used; these RNA values were assigned using the WHO HCV International Standard (NIBSC 96/790). This material is HCV gene type I. The reference material was redissolved in 300 μl of diethyl pyrocarbonate-H2O when used.

Para aumentar la sensibilidad de la RT-PCR, se realizó una segunda amplificación en una mezcla de reacción de 25 μl que contenía 5 μl del producto de amplificación en las mismas condiciones de PCR.

La identidad de los productos de amplificación se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa. Las hebras del producto de PCR 3V de longitud completa se clonaron en vectores pGEM-T Easy (Promega), y luego los clones AT recombinantes se enviaron a Beijing Sunbiotech Co. para secuenciarlos usando cebadores T7 y SP6. Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias diana.

Para determinar la naturaleza del ARN empaquetado en el ARN blindado de 3V, se llevó a cabo la RT del ARN con tres cebadores aguas abajo: Overlap-A, HCV-LAP1 y A-SARS3. Se realizó PCR con los cebadores S-SARS1 y HA300RT-A para amplificar la longitud completa del ARN 3V y con los pares de cebadores S-SARS1 y HCV-LAP1, S-SARS1 y A-SARS3, y S-SARS1 y A-SARS2 para amplificar la secuencia SARS-CoV1 + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 + HCV, la secuencia SARS-CoV1 + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 y la secuencia SARS-CoV1 + SARS-CoV2, respectivamente.

Estabilidad del L-RNA blindado de 3V. Se examinó la estabilidad del L-RNA blindado en suero de ternero recién nacido. Inicialmente, la preparación de L-RNA blindada 3V purificada se cuantificó, por duplicado, con un kit de diagnóstico cuantitativo de fluorescencia de PCR de RNA de HCV (Shanghai Kehua Bio-Engineering Co., Ltd.). El L-RNA blindado cuantificado de 3V se diluyó en serie 10 veces con el suero de ternero recién nacido para obtener 10.000 y 1.000.000 copias / ml. Para cada estudio de estabilidad, se separó un solo lote en alícuotas en muestras puntuales individuales de 100 μl. A continuación, las muestras se incubaron a 4 ° C, 37 ° C o temperatura ambiente. Se extrajeron muestras de plasma de L-RNA blindado 3V en cada punto de tiempo y se almacenaron a -80 ° C hasta la finalización del experimento. Todas las muestras se cuantificaron mediante el uso de un equipo de diagnóstico cuantitativo de fluorescencia de RT-PCR de ARN del VHC (Shanghai Kehua) y un termociclador LightCycler (Roche). A continuación, los datos se analizaron utilizando el software LightCycler (Roche).

Calibración del ARN blindado quimérico contra un estándar internacional para ARN del VHC. Inicialmente, la preparación de L-ARN blindado 3V purificado se cuantificó, por duplicado, utilizando un kit de diagnóstico cuantitativo de fluorescencia de PCR de ARN del VHC (Shanghai Kehua). El L-RNA blindado cuantificado de 3V se diluyó con suero de ternero recién nacido y se prepararon alícuotas de 500 μl mediante dilución en serie de 10 veces para obtener muestras que contenían de 106 a 102 copias / ml.

Para calibrar el ARN blindado quimérico, se utilizó el material de referencia nacional para el ARN del VHC (GBW09151, 2,26 x 103 UI ml − 1 a 4,22 x 107 UI ml − 1); estos valores de ARN se asignaron utilizando el Estándar Internacional de VHC de la OMS (NIBSC 96/790). Este material es el gen del VHC de tipo I. El material de referencia se redisolvió en 300 µl de pirocarbonato de dietilo-H2O cuando se utilizó.

NO ES CASUAL QUE SEAN LAS MISMAS COMUNAS:

LA GENTE ES ZOMBI: HACE LO QUE HACE SIMPLEMENTE PORQUE ES LO QUE «SE» HACE.

SIN SABER POR QUÉ.

ESTÁN ENFERMOS ANTES DE ENFERMAR.

IMPORTARON LA PESTE Y CONTAGIARON A SUS NANAS Y JARDINEROS.

LUEGO ELLOS LLEVARON A LOS BARRIOS POBRES.

¿POR QUÉ PITÉATE A UN FLAITE Y NO PITÉATE UN CUICO?

LA ADORACIÓN AL DINERO HACE QUE QUIENES LOS POSEAN SEAN ADORADOS COMO DIOSES.

UNA SOCIEDAD ASÍ ESTÁ EN DECADENCIA Y PRONTA A DEJAR DE EXISTIR.

DEJARÉ DE ESCRIBIR POR UNA SEMANA. DEBO TENER TIEMPO PARA TERMINAR MI LIBRO.

TAL VEZ PUBLIQUE ALGO MAÑANA. MUCHAS GRACIAS.