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¿ES POSIBLE GANARLE AL DESTINO?

¿ES POSIBLE GANARLE AL DESTINO?

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Para el Diputado Garín, el único que puede

reivindicar los 50.000 muertos de este BICENTENARIO.

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¿Por qué digo que los estadísticos evaden la estadística?

Porque la Estadística es muy clara:

Ningún Orden social se ha refundado. Todos han fracasado presa de sus contradicciones internas.

Simplemente colapsaron bajo el peso de sus taras genéticas.

Eso es lo que llamamos Historia: El Recuento de cómo nacen y mueren civilizaciones completas.

Sumeria, Egipto, Grecia, Roma, Medioevo, ahora nos toca: Adiós Modernidad.

Lo más gracioso es que la única excepción es

¡CHINA!

Porque han permanecido siendo los mismos, han cambiado.

Porque han cambiado, han permanecido.

Como dijo 1 historiador: Es como si en Egipto se siguiese hablando

el mismo lenguaje de los constructores de las pirámides.

La Lengua es todo, la sed es nada.

Los hombres traicionaron la vocación natatoria de la lengua. Vicente Huidobro.

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Lo primero es aclarar el alcance y significado de las palabras y eso NO se ha hecho.

Una de dos: Refundación es una Reforma, más o menos grande,

o Refundación es algo radical, esencial: Remover La piedra angular, como diría Arquitecto.

Es decir, Una Refundación ocurre a cada rato o NO ha ocurrido nunca.

Como ven, soy de la estadística que las civilizaciones sólo saben fracasar.

Lo más gracioso es la similitud entre el hundimiento del Titanic y el de esta Civilización: La Aceleración en un espacio finito. El barco aceleró su desplazamiento; la Civilización, su Crecimiento Económico.
El hecho de ver esta serie me hizo preguntarme: ¿Por qué algo que ocurrió hace décadas, recién es filtrado ahora? En ello vi el presentimiento del futuro cercano, sólo que el Estallido me distrajo y NO correlacioné la señal con la Profecía.

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Einstein ya lo dijo: Sólo hay dos manera de concebir el Cosmos: O Todo es Milagro o Nada es Milagro.

Yo NO creo en los milagros, la gente, en su supina ignorancia, llama milagros a conspiraciones celestes.

Por eso rezar, a veces funciona, cuando está en armonía con los conspiradores celestes.

Volvamos al axioma Fundacional de mi Pensamiento:

Si he de apostar entre la Refundación y el Fracaso Civilizacional: La Estadística me dice:

¡Apuéstale al Fracaso: 100% seguro!

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Ahora vamos al video de la certeza estadística que evade La Estadística. Ya verán por qué:

Básicamente creen que esto va a funcionar. ¡Pobres ilusos! Siempre recordamos con mi musa aquella publicidad donde el perrito movía negativamente su cabeza a su amor que iba presuroso a un cumpleaños y cuyo regalo era un chocolate.

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¿Es Verdad que Derogar la Ley 21.200 o cambiar su matriz castrante es cuestión de Tiempo?

¿Es posible derogar los malditos 2/3?

¿Es posible dejar de aplicar el sistema electoral de diputados a la Convención?

¿Es posible renegociar los Tratados Neoliberales? Cuando hablé con Atria, dijo que sí.

¿Es demasiada ilusa su Visión o realmente AHORAKÍ se puede obtener un mejor trato que el que obtuvo Lagos en su gira por USA para ver si nos aguantaban el pseudo royalty que terminó aprobando y la gente dejó de molestar? Recordemos que eso le costó su vida pública al Senador Lavandero, como antes el proponer la refinación del cobre a Hamilton. YO NO OLVIDO . NI COMPROMETO LA VERDAD, AÚN ANTE LA INMINENCIA DEL ARMAGEDON. EL NUEVO MUNDO SE FUNDARÁ SOBRE MI VCADÁVER. EL PRIMER Y ÚLTIMO HOMBRE, LA FUENTE.

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PROPUESTA ALUCINATORIA.

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¿Podríamos aplicar un sistema de DIPUTADOS NACIONALES?

¡NO LISTAS NI CIFRAS REPARTIDORAS NI ARRASTRES QUE SÓLO COOPTAN LA VOLUNTAD POPULAR!

¿Por qué digo esto?

DIVIDI VINCI.

Al encerrarnos en nuestras localidades, difuminan nuestro Poder.

Tener que estar peleando, circunscripción por circunscripción,

una pequeña fracción de los votos, sólo debilita el poder Soberano del Pueblo.

En cambio si se estableciese un TODOS CONTRA TODOS:

¡LA MÁS ABSOLUTA COMPETENCIA DARWINISTA POR LOST MÁS APTOS!

AHÍ #CiudadRacoon sería DERROTADA APLASTANTEMENTE,

refutando la precaución de Badiou que cito más abajo.

¿VERDAD QUE SÍ?

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La idea es simple: Si 1 persona REUNIE 1.000 FIRMAS

SE HACE CANDIDATO A LA CONSTITUYENTE, como en Islandia,

cuyo ejemplar Proceso se fue a la cresta porque, al final

lo dejaron en manos de su Alianza y Concertación.

Durante la Crisis Subprime los bancos quebraron su nación,

como a Chile en los ’80s, porque los políticos DESRREGULARON el sistema bancario.

¿Permitiremos que los bancos-aseguradoras vuelvan a quebrar a Chile?

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ASÍ LA GENTE VOTA SIN LA CASTRACIÓN DE LAS LISTAS,

QUE SÓLO FAVORECEN A LOS PARTIDOS POLÍTICOS.

ENTONCES SE DICE, ¡NO IMPORTA CUÁNTOS VOTOS SAQUES!

LOS PRIMEROS 155 PUNTAJES NACIONALES ENTRAN A LA UNIVERSIDAD.

¿QUÉ TAL ESE SISTEMA?

¡ESO SÍ QUE SERÍA MITOLÓGICO!

¡ESO SÍ QUE MARCARÍA UN ANTES Y UN DESPUÉS en la galaxia!

PERO SÉ QUE SON SÓLO LAS ALUCINACIONES FEBRILES

DE UN POBRE POETA MUERTO DE POBREZA, depresión y neumonia,

como buen POETA MALDITO.

QUE SE ATREVIÓ a decir la VERDAD y FUE EXPULSADO DE TODAS PARTES,

porque en la plaza de abastos social la pura Verdad, la pura Belleza y la pura Bondad NO TIENEN CABIDA.

Como dice mi madre: NO lo mereces ni te lo has ganado. Lema de mi vida.

En cambio un cabro superficial hasta decir basta, recibió el apoyo de la gente al proponer

volver al sorteo ateniense. ¿Dejarías en manos del azar el Destino de tu vida?

Pensar que desperdicié 50 mil pesos que me hacen falta para que alguien me dijera menos de lo que yo sé.

EL TIPO INSISTÍA EN «PONERLE EMOTIVIDAD» a la política, como si sólo hubiese una, sin caer en la cuenta que existen dos emotividades: La Patriarcal y la Matríztica-filial. Cuando hice saber eso, sólo un hombre mayor que yo lo tenía claro. ¡ESO SÍ QUE ES SER ESTÚPIDO!

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II

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Como dije hace 25 años: LA DEMOCRACIA ES UN CONCURSO DE POPULARIDAD

QUE SIEMPRE TERMINAN GANANDO LOS DICTADORES.

DE NAPOLEÓN A PINOCHET: LA LEY UNIVERSAL DICE:

TODA REVOLUCIÓN SIEMPRE FRACASA, dijeron el Viejo Pepe y Kojeve.

Lo que ellos NO sabían es que DEMOCRACIA y DICTADURA

son sólo dos momentos de lo PATRIARCAL, parafraseando a Debord.

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Sí, el voto o los votos podrían ser kilométricos.

Elegir entre 300 a 600 candidatos es algo complejo, pero los beneficios

superarían largamente las dificultades logísticas.

De esta manera cada diputado sabría «LO QUE PESA» como Repre-sentante Social.

¿Te imaginas Diputados con 300 mil votos y otros con 10 mil o menos?

¿Cuáles serían las consecuencias prácticas de ese «clasismo» entre Convencionales?

¿Quién sacaría más votos: Izkia Siches, Fernando Atria o Stingo?

¡Más encuestas para la Mafia de La Cosa Nostra (de ellos)!

Creo que esa sería LA MEJOR manera de TRASPASAR el Peso del 80% al interior de la Convención.

El Dispositivo de control de los 2/3 sería aplasto por el Híper Quórum de 4/5.

El sistema de partidos + poderes fácticos, la obediencia a los Tratados económicos,

el «Lobby Feroz» de las transnacionales, serían anulados o fuertemente debilitados.

¡Ojo! La Constitución tiene que ser negociada con Tío Sam y China:

¡NO vaya a ser cosa que los hermanos siameses acuerden una tregua…

y envíen sus flotas a reclamar sus empresas de minerales, como en 1879

la marina chilena desembarcó en Antofagasta, para impedir

el remate de las salitreras inglesas a manos de palos blancos chilenos.

QUIEN A HIERRO MATA, A HIERRO MUERE, dice la Sabiduría del Tercer Estado.

Como estamos tan Revolucionarios, digo yo, hay que recordar lo que pasó

durante la Primera Asamblea Constituyente de La Historia.

La primera fue con imprenta y la primera Enciclopedia. Ésta es con Internet y Wikipedia. La Convención convocada por Sebastián II y último,

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REPRESENTAR ES REPRIMIR, POR OTROS MEDIOS.

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Textos de mi primer libro, abortado en 2010, escrito desde 2003, cuando me di cuenta que Lagos era un puto patriarcal-neoliberal el inicio del Ciclo de tormentas Solares, alias protestas sociales. 3 años después los pingüinos me dieron la razón, pero tardé 4 años más en terminarlo.

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TODO PLEBISCITO ES UN ENGAÑO.
ES DEMASIADO FÁCIL SABER QUÉ ES LO QUE QUIERE UNA CIUDADANÍA.
SE LE NOTA EN LA CARA, COMO EL AMOR O DESAMOR, A UNA MUJER.
LONGUEIRA TENÍA RAZÓN: DEBIERON SALTARSE EL PLEBISCITO.
DE ESA MANERA HABRÍAN PRESERVADO EL BLUF DE LOS 2/3,
CONSERVANDO EL PODER DE VETO SOVIÉTICO.
2020 ES A LA DERECHA LO QUE 1990 A LA URSS.
ESO LES PASA POR ESTÚPIDOS.
COMO POR ESTÚPIDOS LE PASÓ A LA IZQUIERDA EN 1973.
NO ENTENDIERON NI A KANT NI A SU NIETO, EINSTEIN:
SI EL UNIVERSO ES LIMITADO, ¡TODO EN SU INTERIOR ES LIMITADO!
ERGO: DEBES PARAR DESPUÉS DE GANAR, dijo Sun Tzú.
Por NO parar, el Niverso los ajustició como a los dinosaurios: por sobrepasar el límite de imbecilidad.

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Yo siendo buleado por Macari.

EL REALISMO SE APODERÓ DEL MUNDO. NO TENGO CABIDA EN ÉL. CUANDO ESTA CIVILIZACIÓN ACABE YA NO ESTARÉ Y PODRÉ DESCANSAR DE TODAS LAS MENTIRAS.

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Santiago: Racoon City. TODO LO MALO VIENE DEL MORDOR NEOLIBERAL. Si yo fuese Marat diría: ¡Vamos Elfos, Enanos y Hobbits a quemar Mordor! Pero esta página se llama IMPORTANCIA DE VIVIR, en honor al chino Lin Yutang, NO El Amigo del Pueblo. Pero lo que SÍ ES CIERTO: SI EL 80% NO ESTÁ DENTRO DE LOS ESTADOS GENERALES CONVOCADOS POR EL QUEBRADO PIÑERA II, (el Estado es incapaz de pagar lost 70.000 millones de dólares que debe a las AFPs) hará que los diputados vuelvan a irse a Jugar a la Pelota y que el Pueblo vaya a las Tullerías, perdón, La Moneda y quede la cagá más 1.

QUIEN DIGA QUE EL PUEBLO ES MALO, SÓLO SE ESTÁ PROYECTANDO, COMO DICE EL ADAGIO:

¿QUEMARON LAS CASONAS Y PALACIOS DE LA ALTA BURGUESÍA?

¿MATARON A LOS HOMBRES, VIOLARON A SUS MUJERES Y SE COMIERON LAS GUAGUAS?

LOS ÚNICOS QUE HACEN ESO SON ELLOS: OTRA ESTADÍSTICA 100% REAL.

Como a nadie le importó que miles de vidas fuesen desperdiciadas, sin auxilio alguno;
NO esperen ser salvados, porque: NO lo merecen ni se lo han ganado.
Sólo cuando esta civilización sea cenizas y hayas
perdido toda esperanza, seré feliz.
Porque ahí recién sentirás
lo que he sentido toda mi vida.
En 2008 ya conocían el SarsCov3

En 2008 ya conocían el SarsCov3

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Para lo 30 mil chilenos que NO debieron morir.

https://jcm.asm.org/content/46/5/1734

https://jcm.asm.org/content/jcm/46/5/1734.full.pdf

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RNase-resistant, noninfectious virus-like particles containing exogenous RNA sequences (armored RNA) are good candidates as RNA controls and standards in RNA virus detection. However, the length of RNA packaged in the virus-like particles with high efficiency is usually less than 500 bases. In this study, we describe a method for producing armored L-RNA. Armored L-RNA is a complex of MS2 bacteriophage coat protein and RNA produced in Escherichia coli by the induction of a two-plasmid coexpression system in which the coat protein and maturase are expressed from one plasmid and the target RNA sequence with modified MS2 stem-loop (pac site) is transcribed from another plasmid. A 3V armored L-RNA of 2,248 bases containing six gene fragments—hepatitis C virus, severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV1, SARS-CoV2, and SARS-CoV3), avian influenza virus matrix gene (M300), and H5N1 avian influenza virus (HA300)—was successfully expressed by the two-plasmid coexpression system and was demonstrated to have all of the characteristics of armored RNA. We evaluated the 3V armored L-RNA as a calibrator for multiple virus assays. We used the WHO International Standard for HCV RNA (NIBSC 96/790) to calibrate the chimeric armored L-RNA, which was diluted by 10-fold serial dilutions to obtain samples containing 106 to 102 copies. In conclusion, the approach we used for armored L-RNA preparation is practical and could reduce the labor and cost of quality control in multiplex RNA virus assays. Furthermore, we can assign the chimeric armored RNA with an international unit for quantitative detection.

Las partículas similares a virus no infecciosas, resistentes a la ARNasa que contienen secuencias de ARN exógenas (ARN blindado) son buenas candidatas como controles y estándares de ARN en la detección de virus ARN. Sin embargo, la longitud del ARN empaquetado en partículas similares a virus con alta eficiencia suele ser inferior a 500 bases. En este estudio, describimos un método para producir L-RNA blindado. El L-ARN blindado es un complejo de proteína de la cubierta del bacteriófago MS2 y ARN producido en Escherichia coli mediante la inducción de un sistema de coexpresión de dos plásmidos en el que la proteína de la cubierta y la maturasa se expresan a partir de un plásmido y la secuencia de ARN diana con el tallo MS2 modificado. loop (sitio pac) se transcribe a partir de otro plásmido. Un L-RNA blindado de 3V de 2248 bases que contiene seis fragmentos de genes: virus de la hepatitis C, coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV1, SARS-CoV2 y SARS-CoV3), gen de la matriz del virus de la influenza aviar (M300) y H5N1 aviar virus de la influenza (HA300): se expresó con éxito mediante el sistema de coexpresión de dos plásmidos y se demostró que tiene todas las características del ARN blindado. Evaluamos el L-RNA blindado de 3V como calibrador para múltiples ensayos de virus. Usamos el Estándar Internacional de la OMS para ARN del VHC (NIBSC 96/790) para calibrar el L-ARN blindado quimérico, que se diluyó mediante diluciones seriadas de 10 veces para obtener muestras que contenían de 106 a 102 copias. En conclusión, el enfoque que usamos para la preparación de L-RNA blindado es práctico y podría reducir la mano de obra y el costo del control de calidad en ensayos de virus de ARN multiplex. Además, podemos asignar al ARN blindado quimérico una unidad internacional para la detección cuantitativa.

Armored RNA is a complex of MS2 bacteriophage coat protein and RNA produced in Escherichia coli by the induction of an expression plasmid that encodes the bacteriophage sequence consisting of the maturase, the coat protein, the pac site, and an exogenous RNA sequence. This method produces recombinant virus-like particles that are noninfectious and contain predefined RNA (2-6, 8, 11, 12, 15, 16, 28). These armored RNAs are RNase resistant by virtue of their encapsulation within an MS2 coat protein, and they have been widely used as controls, standards, or calibrators for the detection of hepatitis C virus (HCV) (11, 12, 28), human immune-deficiency virus (11, 15), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) (3, 11), enterovirus (2, 5), avian influenza virus 5 (4), and West Nile virus (6) using reverse transcription-PCR (RT-PCR), real-time RT-PCR, and branched DNA assays (2-6, 11, 12, 15, 28).

El ARN blindado es un complejo de la proteína de la cubierta del bacteriófago MS2 y el ARN producido en Escherichia coli mediante la inducción de un plásmido de expresión que codifica la secuencia del bacteriófago que consiste en la maturasa, la proteína de la cubierta, el sitio pac y una secuencia de ARN exógena. Este método produce partículas similares a virus recombinantes que no son infecciosas y contienen ARN predefinido (2-6, 8, 11, 12, 15, 16, 28). Estos ARN blindados son resistentes a la ARNasa en virtud de su encapsulación dentro de una proteína de cubierta MS2, y se han utilizado ampliamente como controles, estándares o calibradores para la detección del virus de la hepatitis C (VHC) (11, 12, 28), inmunológico humano -virus de la deficiencia (11, 15), coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) (3, 11), enterovirus (2, 5), virus de la influenza aviar 5 (4) y virus del Nilo Occidental (6) mediante transcripción inversa -PCR (RT-PCR), RT-PCR en tiempo real y ensayos de ADN ramificado (2-6, 11, 12, 15, 28).

The MS2 bacteriophage consists of 180 U of the bacteriophage coat protein that encapsulates the bacteriophage genome (25). The MS2 phage RNA genome comprises a single plus-sense strand encoding 3,569 nucleotides. The genes are organized from the 5′ end as follows: the maturase or A protein, the bacteriophage coat protein, a 75-amino-acid lysis protein, and a replicase subunit. Packaging of the RNA genome by coat protein is initiated by high-specificity binding to a unique site on the RNA, a single stem-loop structure, containing the initiation codon of the gene for the viral replicase. The armored RNA contains approximately 1.7 kb of bacteriophage RNA sequence encoding the maturase, the coat protein, and the pac site. The wild-type MS2 bacteriophage contains an RNA genome of approximately 3.6 kb. In addition, the extensively folded nature of MS2 RNA (22) may make it particularly suitable for uptake into the confines of a small capsid. Thus, theoretically, at most, 1.9 kb of nonbacteriophage RNA sequence might be encapsulated by this method. Practically, the packaging of 500 bases of RNA has been demonstrated to be very efficient; however, packaging of 1- and 1.5-kb amounts of RNA is inefficient (15). Recently, Huang et al. (11) used armored RNA technology to package a 1,200-nucleotide foreign RNA sequence by deleting some disposable sequences between the multiple cloning site and the transcription terminator; however, to date, there have been no reports of armored RNA with sizes greater than 1,200 bp.

El bacteriófago MS2 consta de 180 U de la proteína de la cubierta del bacteriófago que encapsula el genoma del bacteriófago (25). El genoma del ARN del fago de MS2 comprende una única hebra de sentido positivo que codifica 3.569 nucleótidos. Los genes se organizan desde el extremo 5 ‘de la siguiente manera: la proteína maturasa o A, la proteína de la cubierta del bacteriófago, una proteína de lisis de 75 aminoácidos y una subunidad de replicasa. El empaquetamiento del genoma del ARN por la proteína de la cubierta se inicia mediante la unión de alta especificidad a un sitio único en el ARN, una estructura de tallo-bucle único, que contiene el codón de inicio del gen para la replicasa viral. El ARN blindado contiene aproximadamente 1,7 kb de secuencia de ARN de bacteriófago que codifica la maturasa, la proteína de la cubierta y el sitio pac. El bacteriófago MS2 de tipo salvaje contiene un genoma de ARN de aproximadamente 3,6 kb. Además, la naturaleza extensivamente plegada del ARN de MS2 (22) puede hacer que sea particularmente adecuado para la absorción en los confines de una pequeña cápside. Por tanto, teóricamente, como máximo, 1,9 kb de secuencia de ARN no bacteriófago podrían encapsularse mediante este método. En la práctica, se ha demostrado que el envasado de 500 bases de ARN es muy eficaz; sin embargo, el empaquetado de cantidades de ARN de 1 y 1,5 kb es ineficaz (15). Recientemente, Huang et al. (11) utilizaron tecnología de ARN blindado para empaquetar una secuencia de ARN extraño de 1200 nucleótidos eliminando algunas secuencias desechables entre el sitio de clonación múltiple y el terminador de la transcripción; sin embargo, hasta la fecha, no ha habido informes de ARN blindado con tamaños superiores a 1200 bp.

Although most RT-PCR assays do not target RNA sequences longer than 500 bases, there are some advantages if longer target RNA sequences are packaged. For example, the human immunodeficiency virus Quantiplex assay (Chiron Corp.) uses a standard that is approximately 3 kb in length; consequently, it is not possible to produce a single armored RNA standard for this assay using routine armored RNA technology. A further advantage of using armored RNA of several kilobases is that PCR primers for different regions of these genes may be used with a single armored RNA standard. Accordingly, it is not necessary to construct a different armored RNA standard for each PCR primer pair that might be used. With such a standard, different research groups and clinical laboratories could directly compare their quantitative data. In addition, if long RNA sequences were to be packaged, we could produce a single chimeric armored RNA standard and control that could meet the needs of a variety of different viral assays designed to detect different viral genomes. This would in turn simplify and reduce the cost of multivirus detection. Furthermore, if chimeric armored RNA sequences from different RNA viruses contain an HCV 5′ untranslated region (5′UTR), we could easily assign the chimeric armored RNA with an international unit for quantitative detection since an international standard for HCV RNA is available from the National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC) (20, 21).

Aunque la mayoría de los ensayos de RT-PCR no se dirigen a secuencias de ARN de más de 500 bases, existen algunas ventajas si se empaquetan secuencias de ARN objetivo más largas. Por ejemplo, el ensayo Quantiplex del virus de la inmunodeficiencia humana (Chiron Corp.) usa un estándar que tiene aproximadamente 3 kb de longitud; en consecuencia, no es posible producir un solo estándar de ARN blindado para este ensayo utilizando tecnología de ARN blindado de rutina. Una ventaja adicional de usar ARN blindado de varias kilobases es que se pueden usar cebadores de PCR para diferentes regiones de estos genes con un solo estándar de ARN blindado. Por consiguiente, no es necesario construir un estándar de ARN blindado diferente para cada par de cebadores de PCR que pueda usarse. Con tal estándar, diferentes grupos de investigación y laboratorios clínicos podrían comparar directamente sus datos cuantitativos. Además, si se empaquetaran secuencias largas de ARN, podríamos producir un solo estándar y control de ARN blindado quimérico que podría satisfacer las necesidades de una variedad de diferentes ensayos virales diseñados para detectar diferentes genomas virales. Esto, a su vez, simplificaría y reduciría el costo de la detección de virus múltiples. Además, si las secuencias de ARN blindado quimérico de diferentes virus de ARN contienen una región no traducida 5 ′ del VHC (5’UTR), podríamos asignar fácilmente al ARN blindado quimérico una unidad internacional para la detección cuantitativa ya que un estándar internacional para el ARN del VHC está disponible en Instituto Nacional de Estándares y Controles Biológicos (NIBSC) (20, 21).

Although most RT-PCR assays do not target RNA sequences longer than 500 bases, there are some advantages if longer target RNA sequences are packaged. For example, the human immunodeficiency virus Quantiplex assay (Chiron Corp.) uses a standard that is approximately 3 kb in length; consequently, it is not possible to produce a single armored RNA standard for this assay using routine armored RNA technology. A further advantage of using armored RNA of several kilobases is that PCR primers for different regions of these genes may be used with a single armored RNA standard. Accordingly, it is not necessary to construct a different armored RNA standard for each PCR primer pair that might be used. With such a standard, different research groups and clinical laboratories could directly compare their quantitative data. In addition, if long RNA sequences were to be packaged, we could produce a single chimeric armored RNA standard and control that could meet the needs of a variety of different viral assays designed to detect different viral genomes. This would in turn simplify and reduce the cost of multivirus detection. Furthermore, if chimeric armored RNA sequences from different RNA viruses contain an HCV 5′ untranslated region (5′UTR), we could easily assign the chimeric armored RNA with an international unit for quantitative detection since an international standard for HCV RNA is available from the National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC) (20, 21).

Aunque la mayoría de los ensayos de RT-PCR no se dirigen a secuencias de ARN de más de 500 bases, existen algunas ventajas si se empaquetan secuencias de ARN objetivo más largas. Por ejemplo, el ensayo Quantiplex del virus de la inmunodeficiencia humana (Chiron Corp.) usa un estándar que tiene aproximadamente 3 kb de longitud; en consecuencia, no es posible producir un solo estándar de ARN blindado para este ensayo utilizando tecnología de ARN blindado de rutina. Una ventaja adicional de usar ARN blindado de varias kilobases es que se pueden usar cebadores de PCR para diferentes regiones de estos genes con un solo estándar de ARN blindado. Por consiguiente, no es necesario construir un estándar de ARN blindado diferente para cada par de cebadores de PCR que pueda usarse. Con tal estándar, diferentes grupos de investigación y laboratorios clínicos podrían comparar directamente sus datos cuantitativos. Además, si se empaquetaran secuencias largas de ARN, podríamos producir un solo estándar y control de ARN blindado quimérico que podría satisfacer las necesidades de una variedad de diferentes ensayos virales diseñados para detectar diferentes genomas virales. Esto, a su vez, simplificaría y reduciría el costo de la detección de virus múltiples. Además, si las secuencias de ARN blindado quimérico de diferentes virus de ARN contienen una región no traducida 5 ′ del VHC (5’UTR), podríamos asignar fácilmente al ARN blindado quimérico una unidad internacional para la detección cuantitativa ya que un estándar internacional para el ARN del VHC está disponible en Instituto Nacional de Estándares y Controles Biológicos (NIBSC) (20, 21).

MATERIALS AND METHODS

Construction of pET-MC.MS2 maturase and coat protein genes were amplified by using primers S-MC and A-MC (Table 1) from the pMS27 plasmid (kindly provided by D. S. Peabody) containing nucleotides (nt) 81 to 1749 of the MS2 bacteriophage gene (GenBank accession no. V00642). Sense and reverse primers contained BamHI and HindIII restriction sites (underlined), respectively. These primers correspond to nt 81 to 101 and nt 1721 to 1741 of the MS2 phage genome sequence. The 1.7-kb PCR-amplified DNA fragments were gel purified, digested with BamHI and HindIII, and then ligated to a linearized pET28b (Novagen) vector to generate the recombinant plasmid pET-MC. This plasmid was transformed into competent E. coli DH5α cells according to the manufacturer’s instructions. The pET-MC plasmids in positive clones that could replicate in LB agar in the presence of 100 μg of kanamycin ml−1 were isolated by using a Takara MiniBEST plasmid purification kit (TaKaRa). The DNA insert was sequenced with vector-specific primers using an automated fluorescent DNA sequencer (model 3730XL; Applied Biosystems). The resulting sequences were identified by a search of the NCBI databases for homologous sequences using BLAST.

MATERIALES Y MÉTODOS

La construcción de pET-MC.MS2 maturasa y los genes de la proteína de la cubierta se amplificaron utilizando los cebadores S-MC y A-MC (Tabla 1) del plásmido pMS27 (proporcionado amablemente por DS Peabody) que contiene los nucleótidos (nt) 81 a 1749 de la MS2. gen del bacteriófago (nº de acceso de GenBank V00642). Los cebadores de sentido e inverso contenían sitios de restricción BamHI y HindIII (subrayados), respectivamente. Estos cebadores corresponden al nt 81 a 101 y al nt 1721 a 1741 de la secuencia del genoma del fago MS2. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR de 1,7 kb se purificaron en gel, se digirieron con BamHI y HindIII, y luego se ligaron a un vector pET28b linealizado (Novagen) para generar el plásmido pET-MC recombinante. Este plásmido se transformó en células E. coli DH5α competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos pET-MC de los clones positivos que podían replicarse en agar LB en presencia de 100 µg de kanamicina ml-1 se aislaron utilizando un kit de purificación de plásmidos Takara MiniBEST (TaKaRa). El inserto de ADN se secuenció con cebadores específicos de vector utilizando un secuenciador de ADN fluorescente automático (modelo 3730XL; Applied Biosystems). Las secuencias resultantes se identificaron mediante una búsqueda en las bases de datos del NCBI de secuencias homólogas usando BLAST.

Construction of pACYC-3V.An exogenous chimeric sequence 2,248 bp in length comprising the following sequences was inserted into a pACYCDuet-1 plasmid (p15A-type replication origin; Novagen): M-300 (nt 17∼373, 357 bp from avian influenza virus matrix gene; GenBank accession no. DQ864720), SARS-CoV1 (nt 15224 to 15618, 395 bp from SARS-CoV; GenBank accession no. AY864806), SARS-CoV2 (nt 18038 to 18340, 303 bp from SARS-CoV; GenBank accession no. AY864806), SARS-CoV3 (nt 328110 to 28692, 583 bp from SARS-CoV; GenBank accession no. AY864806), a pac site (19 bp), HCV (nt 18 to 310, 293 bp from HCV 5′UTR; GenBank accession no. AF139594), and HA300 (nt 295 to 611, 317 bp from H5N1 avian influenza virus; GenBank accession no. DQ864720). The target sequence included the forward and reverse primer sites, flanking regions, and probe-binding sites previously published or described. A 19-mer pac site was placed between SARS-CoV3 and HCV (Fig. 1). We spliced the six target DNA sequences using overlapping extensions (10). During the first-round PCR, these six small fragments were amplified as follows. SARS-CoV1 was amplified from a pBSSR-V6 plasmid (kindly provided by the Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Institute of Basic Medical Sciences), containing nt 13785 to 16051 of the SARS-CoV gene, using the primers S-SARS1 and LAP-SARS1. SARS-CoV2 was amplified from a pNCCL-SARS plasmid (constructed by our laboratory), containing nt 18038 to 18340 of the SARS-CoV gene, using the primers LAP-SARS2 and A-SARS2. SARS-CoV3 was amplified from a pBSSR7-8 plasmid (kindly provided by the Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Institute of Basic Medical Sciences), containing nt 27730 to 29212 of the SARS-CoV gene, using the primers LAP-SARS3 and A-SARS3. The HCV fragment was amplified from a pNCCL-HCV plasmid (constructed by our laboratory), containing nt 18 to 310 of the HCV gene, using the primers S-HCV and HCV-LAP1(underlined for 19mer pac site). HA300 was amplified from a pNCCL-H5N1 plasmid (constructed by our laboratory) using the primers HA300LAP and A-HA300. M300 was amplified from a pNCCL-H5N1 plasmid (constructed by our laboratory) using the primers M300-S′ and M+SLAP1. The PCR products from the first-round amplifications were gel purified and used, together with outside primers, in the overlap extension PCR. In the second-round PCR, amplified SARS-CoV1 plus SARS-CoV2 and HCV plus HA300 were amplified using the primers pairs S-SARS1-LAP-SARS2+ and FIVELAP2-OverlapA′, respectively. The PCR products from the second round were gel purified. The third-round PCR amplified SARS-CoV1 plus SARS-CoV2 plus SARS-CoV3 using the primers M+SLAP2 and FIVELAP1. The PCR products from the third round were gel purified. The fourth-round PCR amplified SARS-CoV1 plus SARS-CoV2 plus SARS-CoV3 plus HCV plus HA300 using primers M+SLAP2 and OverlapA′. The fifth-round PCR amplified M300 plus SARS-CoV1 plus SARS-CoV2 plus SARS-CoV3 plus HCV plus HA300 using the primers M300-S′ and OverlapA′. Sense and reverse primers contained FseI and PacI restriction sites (underlined in Table 1), respectively. The fifth-round PCR products were gel purified. The purified fragments were cloned into a pGEM-T Easy vector (Promega) and then excised from the resulting recombinant plasmid with the FseI and PacI restriction enzymes. Simultaneously, the pACYCDuet-1 plasmid was digested with FseI and PacI, and the resulting fragments were ligated into the linearized pACYCDuet-1 plasmid to produce a new donor plasmid (pACYC-3V). pACYC-3V plasmids in positive clones, which could replicate on LB agar in the presence of 100 μg of chloramphenicol ml−1, were confirmed by PCR and sequencing.

Construcción de pACYC-3V.Una secuencia quimérica exógena de 2248 pb de longitud que comprende las siguientes secuencias se insertó en un plásmido pACYCDuet-1 (origen de replicación de tipo p15A; Novagen): M-300 (nt 17∼373, 357 pb de influenza aviar gen de la matriz del virus; número de acceso de GenBank DQ864720), SARS-CoV1 (nt 15224 a 15618, 395 pb de SARS-CoV; número de acceso de GenBank AY864806), SARS-CoV2 (nt 18038 a 18340, 303 pb de SARS-CoV; Número de acceso de GenBank AY864806), SARS-CoV3 (nt 328110 a 28692, 583 pb de SARS-CoV; número de acceso de GenBank AY864806), un sitio pac (19 pb), VHC (nt 18 a 310, 293 pb de HCV 5 ‘UTR; número de acceso de GenBank AF139594) y HA300 (nt 295 a 611, 317 pb del virus de la influenza aviar H5N1; número de acceso de GenBank DQ864720). La secuencia diana incluía los sitios del cebador directo e inverso, las regiones flanqueantes y los sitios de unión a la sonda publicados o descritos anteriormente. Se colocó un sitio pac de 19 meros entre el SARS-CoV3 y el VHC (Fig. 1). Empalmamos las seis secuencias de ADN diana utilizando extensiones superpuestas (10). Durante la primera ronda de PCR, estos seis pequeños fragmentos se amplificaron como sigue. El SARS-CoV1 se amplificó a partir de un plásmido pBSSR-V6 (proporcionado amablemente por la Academia China de Ciencias Médicas y el Colegio Médico de la Unión de Pekín, Instituto de Ciencias Médicas Básicas), que contiene nt 13785 a 16051 del gen SARS-CoV, utilizando los cebadores S -SARS1 y LAP-SARS1. El SARS-CoV2 se amplificó a partir de un plásmido pNCCL-SARS (construido por nuestro laboratorio), que contenía nt 18038 a 18340 del gen SARS-CoV, utilizando los cebadores LAP-SARS2 y A-SARS2. El SARS-CoV3 se amplificó a partir de un plásmido pBSSR7-8 (proporcionado amablemente por la Academia China de Ciencias Médicas y el Peking Union Medical College, Instituto de Ciencias Médicas Básicas), que contiene nt 27730 a 29212 del gen SARS-CoV, utilizando los cebadores LAP -SARS3 y A-SARS3. El fragmento de HCV se amplificó a partir de un plásmido pNCCL-HCV (construido por nuestro laboratorio), que contenía entre 18 y 310 nt del gen del HCV, utilizando los cebadores S-HCV y HCV-LAP1 (subrayado para el sitio pac 19mer). HA300 se amplificó a partir de un plásmido pNCCL-H5N1 (construido por nuestro laboratorio) utilizando los cebadores HA300LAP y A-HA300. M300 se amplificó a partir de un plásmido pNCCL-H5N1 (construido por nuestro laboratorio) utilizando los cebadores M300-S ‘y M + SLAP1. Los productos de PCR de las amplificaciones de la primera ronda se purificaron en gel y se usaron, junto con los cebadores externos, en la PCR de extensión por superposición. En la segunda ronda de PCR, se amplificaron SARS-CoV1 más SARS-CoV2 y HCV más HA300 utilizando los pares de cebadores S-SARS1-LAP-SARS2 + y FIVELAP2-OverlapA ‘, respectivamente. Los productos de PCR de la segunda ronda se purificaron en gel. La PCR de tercera ronda amplificó SARS-CoV1 más SARS-CoV2 más SARS-CoV3 utilizando los cebadores M + SLAP2 y FIVELAP1. Los productos de PCR de la tercera ronda se purificaron en gel. La PCR de cuarta ronda amplificó SARS-CoV1 más SARS-CoV2 más SARS-CoV3 más HCV más HA300 utilizando los cebadores M + SLAP2 y OverlapA ′. La PCR de quinta ronda amplificó M300 más SARS-CoV1 más SARS-CoV2 más SARS-CoV3 más HCV más HA300 utilizando los cebadores M300-S ′ y OverlapA ′. Los cebadores de sentido e inverso contenían sitios de restricción FseI y PacI (subrayados en la Tabla 1), respectivamente. Los productos de PCR de la quinta ronda se purificaron en gel. Los fragmentos purificados se clonaron en un vector pGEM-T Easy (Promega) y luego se escindieron del plásmido recombinante resultante con las enzimas de restricción FseI y PacI. Simultáneamente, el plásmido pACYCDuet-1 se digirió con FseI y PacI, y los fragmentos resultantes se ligaron en el plásmido pACYCDuet-1 linealizado para producir un nuevo plásmido donante (pACYC-3V). Los plásmidos pACYC-3V en clones positivos, que podían replicarse en agar LB en presencia de 100 μg de cloranfenicol ml-1, se confirmaron mediante PCR y secuenciación.

Construction of pET-MS2-3V.In order to compare armored RNA particles and armored L-RNA particles, we constructed pET-MS2-3V according to routine armored RNA technology (15). The DNAs encoding the maturase; the coat protein; the pac site; and the exogenous chimeric sequence (1,900 bp) containing SARS-CoV1, SARS-CoV2, SARS-CoV3, HCV, and HA300 were cloned downstream of the inducible T7 promoter of pET28b.

Expression and purification of virus-like particles.Both pET-MC and pACYC-3V plasmids were cotransformed into E. coli strain BL21(DE3). The 3V armored L-RNA was expressed as described previously (16). The cells were harvested by centrifugation and then washed three times with phosphate-buffered saline. The cells were pelleted and then resuspended in 20 ml of sonication buffer (5 mM MgSO4, 0.1 M NaCl, 50 mM Tris [pH 8.0]). The cells were sonicated (Branson Sonifier 350) by using a small sonication probe operating at 50% duty cycle (unit 5 power) for five pulses. The sonicate was placed on ice for 1 min, and then the sonication step was repeated another five times. The sonicate was centrifuged in order to pellet the cell debris. A total of 20 ml of supernatant was then incubated with 1,000 U of E. coli RNase 1 and 200 U of bovine pancreatic DNase 1 at 37°C for 40 min in order to eliminate E. coli RNA and DNA. After nuclease treatment, 5 μl of supernatant was electrophoresed on an agarose gel in TAE buffer and stained with ethidium bromide to assay for armored L-RNA. A CsCl gradient was then performed as the standard method (16). In order to compare the densities of 3V armored L-RNA and 3V armored RNA particles, the 3V armored RNA from pET-MS2-3V was expressed as described previously (16). Each RNA was loaded on separate gradients. After ultracentrifugation, the ultracentrifugation tube was stabilized in an upright position. An 18-gauge needle was slowly inserted into the bottom of the tube, and 0.5-ml fractions were collected and weighed in order to determine the density of the CsCl. The optical density of each fraction at 260 nm was measured in order to quantify the 3V armored L-RNA and 3V armored RNA particles. A 5-μl portion of each fraction was electrophoresed on an agarose gel in TAE buffer and stained with ethidium bromide in order to determine the fractions containing armored L-RNA and those containing armored RNA. The fractions were then pooled and dialyzed against sonication buffer in order to remove CsCl. The dialysate was collected and stored at 4°C.

Construcción de pET-MS2-3V.Para comparar partículas de ARN blindado y partículas de L-RNA blindado, construimos pET-MS2-3V de acuerdo con la tecnología de ARN blindado de rutina (15). Los ADN que codifican la madurasa; la proteína de la capa; el sitio pac; y la secuencia quimérica exógena (1900 pb) que contenía SARS-CoV1, SARS-CoV2, SARS-CoV3, HCV y HA300 se clonaron corriente abajo del promotor inducible T7 de pET28b.

Expresión y purificación de partículas similares a virus. Los plásmidos pET-MC y pACYC-3V se cotransformaron en la cepa de E. coli BL21 (DE3). El L-RNA blindado de 3V se expresó como se describió anteriormente (16). Las células se recolectaron por centrifugación y luego se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato. Las células se sedimentaron y luego se resuspendieron en 20 ml de tampón de sonicación (MgSO4 5 mM, NaCl 0,1 M, Tris 50 mM [pH 8,0]). Las células se sometieron a ultrasonidos (Branson Sonifier 350) utilizando una pequeña sonda de sonicación que funciona al 50% del ciclo de trabajo (unidad 5 de potencia) durante cinco pulsos. El sonicado se colocó en hielo durante 1 minuto y luego se repitió el paso de sonicación otras cinco veces. El sonicado se centrifugó con el fin de sedimentar los restos celulares. A continuación, se incubó un total de 20 ml de sobrenadante con 1.000 U de ARNasa 1 de E. coli y 200 U de ADNasa 1 pancreática bovina a 37 ° C durante 40 min para eliminar el ARN y el ADN de E. coli. Después del tratamiento con nucleasa, se sometieron a electroforesis 5 µl de sobrenadante en un gel de agarosa en tampón TAE y se tiñeron con bromuro de etidio para analizar el L-ARN blindado. A continuación, se realizó un gradiente de CsCl como método estándar (16). Con el fin de comparar las densidades de las partículas de L-RNA blindado de 3V y de las partículas de ARN blindado de 3V, el ARN blindado de 3V de pET-MS2-3V se expresó como se describió anteriormente (16). Cada ARN se cargó en gradientes separados. Después de la ultracentrifugación, el tubo de ultracentrifugación se estabilizó en posición vertical. Se insertó lentamente una aguja de calibre 18 en el fondo del tubo y se recogieron y pesaron fracciones de 0,5 ml para determinar la densidad del CsCl. Se midió la densidad óptica de cada fracción a 260 nm con el fin de cuantificar las partículas de L-RNA blindado de 3V y de ARN blindado de 3V. Una porción de 5 µl de cada fracción se sometió a electroforesis en un gel de agarosa en tampón TAE y se tiñó con bromuro de etidio para determinar las fracciones que contienen L-RNA blindado y aquellas que contienen RNA blindado. A continuación, las fracciones se combinaron y se dializaron frente a tampón de sonicación para eliminar el CsCl. El dializado se recogió y se almacenó a 4 ° C.

RNA extraction.RNA was extracted from 140 μl of the purified armored L-RNA by using a QIAamp viral RNA minikit (Qiagen) according to the manufacturer’s instructions. The extracted RNA was eluted in 60 μl of diethyl pyrocarbonate-treated H2O and then used as a template for RT-PCR and RNA electrophoresis.

Identification of armored L-RNA by RT-PCR.RT of the 3V armored L-RNA was carried out by using the Overlap-A downstream primer; this primer corresponds to nt 581 to 605 of the H5N1 gene. PCR was carried out with the primers M300RT-S and HA300RT-A in order to amplify the full length of the 3V L-RNA. RT-PCR was conducted in separate (two-step) reactions by using an Eppendorf PCR system Autorisierter thermal cycler (Eppendorf). For the RT step, each reaction mixture (20 μl) contained 4 μl of first-strand buffer (Invitrogen), 1 μl of 10 mM deoxynucleoside triphosphates, 1 μl of RNaseOUT, 1 μl of 0.1 mM dithiothreitol, 1 μl of reverse primer (Overlap-A), 1 μl of SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen), 5 μl of RNA, and sterile distilled water to 20 μl. The reaction mixture was incubated initially at 55°C for 50 min and then at 70°C for 15 min. An aliquot (5 μl) of the resulting cDNA was amplified by PCR using a 25-μl mixture that contained 1× PCR buffer (Promega), 1.5 mM MgCl2, 300 μM deoxynucleoside triphosphate, 1.5 μM concentrations of each primer, and 1.25 U of Taq DNA polymerase (Promega). After an initial incubation at 95°C for 3 min, 40 cycles of the following temperature conditions were used: 95°C for 30 s, 56°C for 30 s, and 72°C for 140 s. A final extension at 72°C for 10 min was performed. Several controls, including a negative control with no template, a positive control with DNA from pACYC-3V, and a negative control with supernatant of the virus-like particles without RT, were tested simultaneously. PCR products (5 μl) were analyzed by electrophoresis on agarose gels containing ethidium bromide.

Extracción de ARN: se extrajo ARN de 140 μl del L-ARN blindado purificado utilizando un minikit de ARN viral QIAamp (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN extraído se eluyó en 60 μl de H2O tratada con pirocarbonato de dietilo y luego se usó como molde para RT-PCR y electroforesis de ARN.

Identificación de L-RNA blindado por RT-PCR. La RT del L-RNA blindado de 3V se llevó a cabo utilizando el cebador Overlap-A corriente abajo; este cebador corresponde a nt 581 a 605 del gen H5N1. La PCR se llevó a cabo con los cebadores M300RT-S y HA300RT-A para amplificar la longitud completa del L-RNA de 3V. La RT-PCR se llevó a cabo en reacciones separadas (de dos pasos) utilizando un ciclador térmico Autorisierter del sistema Eppendorf PCR (Eppendorf). Para el paso de RT, cada mezcla de reacción (20 μl) contenía 4 μl de tampón de primera hebra (Invitrogen), 1 μl de desoxinucleósidos trifosfatos 10 mM, 1 μl de RNaseOUT, 1 μl de ditiotreitol 0,1 mM, 1 μl de cebador inverso ( Overlap-A), 1 μl de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen), 5 μl de ARN y agua destilada estéril hasta 20 μl. La mezcla de reacción se incubó inicialmente a 55 ° C durante 50 min y luego a 70 ° C durante 15 min. Se amplificó una alícuota (5 μl) del ADNc resultante mediante PCR utilizando una mezcla de 25 μl que contenía 1 × tampón de PCR (Promega), MgCl2 1,5 mM, trifosfato de desoxinucleósido 300 μM, concentraciones de 1,5 μM de cada cebador y 1,25 U de Taq ADN polimerasa (Promega). Después de una incubación inicial a 95 ° C durante 3 min, se utilizaron 40 ciclos de las siguientes condiciones de temperatura: 95 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 sy 72 ° C durante 140 s. Se realizó una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Se ensayaron simultáneamente varios controles, incluido un control negativo sin molde, un control positivo con ADN de pACYC-3V y un control negativo con sobrenadante de partículas similares a virus sin RT. Los productos de PCR (5 µl) se analizaron por electroforesis en geles de agarosa que contenían bromuro de etidio.

In order to increase the sensitivity of the RT-PCR, a second amplification was performed in a 25-μl reaction mixture containing 5 μl of the amplification product under the same PCR conditions.

The identity of the amplification products was confirmed by agarose gel electrophoresis. The strands of full-length 3V PCR product were cloned into pGEM-T Easy vectors (Promega), and then the recombinant AT clones were sent to Beijing Sunbiotech Co. to be sequenced using T7 and SP6 primers. The sequences obtained were compared to the target sequences.

In order to determine the nature of the RNA packaged into 3V armored RNA, RT of the RNA was carried out with three downstream primers: Overlap-A, HCV-LAP1, and A-SARS3. PCR was carried out with the primers S-SARS1 and HA300RT-A in order to amplify the full length of the 3V RNA and with the primer pairs S-SARS1 and HCV-LAP1, S-SARS1 and A-SARS3, and S-SARS1 and A-SARS2 to amplify the SARS-CoV1+SARS-CoV2+SARS-CoV3+HCV sequence, the SARS-CoV1+SARS-CoV2+SARS-CoV3 sequence, and the SARS-CoV1+SARS-CoV2 sequence, respectively.

Stability of 3V armored L-RNA.The armored L-RNA was examined for stability in newborn calf serum. Initially, the purified 3V armored L-RNA preparation was quantified, in duplicate, with an HCV RNA PCR fluorescence quantitative diagnostic kit (Shanghai Kehua Bio-Engineering Co., Ltd.). The quantified 3V armored L-RNA was serially diluted 10-fold with the newborn calf serum to obtain 10,000 and 1,000,000 copies/ml. For each stability study, a single batch was separated into aliquots in individual time point samples of 100 μl. The samples were then incubated at 4°C, 37°C, or room temperature. 3V armored L-RNA plasma samples were removed at each time point and were stored at −80°C until completion of the experiment. All samples were quantified by using an HCV RNA RT-PCR fluorescence quantitative diagnostic kit (Shanghai Kehua) and LightCycler thermal cycler (Roche). The data were then analyzed by using LightCycler software (Roche).

Calibration of the chimeric armored RNA against an international standard for HCV RNA.Initially, the purified 3V armored L-RNA preparation was quantified, in duplicate, using a HCV RNA PCR fluorescence quantitative diagnostic kit (Shanghai Kehua). The quantified 3V armored L-RNA was diluted with newborn calf serum, and 500-μl aliquots were prepared by 10-fold serial dilution to obtain samples containing 106 to 102 copies/ml.

In order to calibrate the chimeric armored RNA, the National Reference material for HCV RNA (GBW09151, 2.26 × 103 IU ml−1 to 4.22 × 107 IU ml−1) was used; these RNA values were assigned using the WHO HCV International Standard (NIBSC 96/790). This material is HCV gene type I. The reference material was redissolved in 300 μl of diethyl pyrocarbonate-H2O when used.

Para aumentar la sensibilidad de la RT-PCR, se realizó una segunda amplificación en una mezcla de reacción de 25 μl que contenía 5 μl del producto de amplificación en las mismas condiciones de PCR.

La identidad de los productos de amplificación se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa. Las hebras del producto de PCR 3V de longitud completa se clonaron en vectores pGEM-T Easy (Promega), y luego los clones AT recombinantes se enviaron a Beijing Sunbiotech Co. para secuenciarlos usando cebadores T7 y SP6. Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias diana.

Para determinar la naturaleza del ARN empaquetado en el ARN blindado de 3V, se llevó a cabo la RT del ARN con tres cebadores aguas abajo: Overlap-A, HCV-LAP1 y A-SARS3. Se realizó PCR con los cebadores S-SARS1 y HA300RT-A para amplificar la longitud completa del ARN 3V y con los pares de cebadores S-SARS1 y HCV-LAP1, S-SARS1 y A-SARS3, y S-SARS1 y A-SARS2 para amplificar la secuencia SARS-CoV1 + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 + HCV, la secuencia SARS-CoV1 + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 y la secuencia SARS-CoV1 + SARS-CoV2, respectivamente.

Estabilidad del L-RNA blindado de 3V. Se examinó la estabilidad del L-RNA blindado en suero de ternero recién nacido. Inicialmente, la preparación de L-RNA blindada 3V purificada se cuantificó, por duplicado, con un kit de diagnóstico cuantitativo de fluorescencia de PCR de RNA de HCV (Shanghai Kehua Bio-Engineering Co., Ltd.). El L-RNA blindado cuantificado de 3V se diluyó en serie 10 veces con el suero de ternero recién nacido para obtener 10.000 y 1.000.000 copias / ml. Para cada estudio de estabilidad, se separó un solo lote en alícuotas en muestras puntuales individuales de 100 μl. A continuación, las muestras se incubaron a 4 ° C, 37 ° C o temperatura ambiente. Se extrajeron muestras de plasma de L-RNA blindado 3V en cada punto de tiempo y se almacenaron a -80 ° C hasta la finalización del experimento. Todas las muestras se cuantificaron mediante el uso de un equipo de diagnóstico cuantitativo de fluorescencia de RT-PCR de ARN del VHC (Shanghai Kehua) y un termociclador LightCycler (Roche). A continuación, los datos se analizaron utilizando el software LightCycler (Roche).

Calibración del ARN blindado quimérico contra un estándar internacional para ARN del VHC. Inicialmente, la preparación de L-ARN blindado 3V purificado se cuantificó, por duplicado, utilizando un kit de diagnóstico cuantitativo de fluorescencia de PCR de ARN del VHC (Shanghai Kehua). El L-RNA blindado cuantificado de 3V se diluyó con suero de ternero recién nacido y se prepararon alícuotas de 500 μl mediante dilución en serie de 10 veces para obtener muestras que contenían de 106 a 102 copias / ml.

Para calibrar el ARN blindado quimérico, se utilizó el material de referencia nacional para el ARN del VHC (GBW09151, 2,26 x 103 UI ml − 1 a 4,22 x 107 UI ml − 1); estos valores de ARN se asignaron utilizando el Estándar Internacional de VHC de la OMS (NIBSC 96/790). Este material es el gen del VHC de tipo I. El material de referencia se redisolvió en 300 µl de pirocarbonato de dietilo-H2O cuando se utilizó.

NO ES CASUAL QUE SEAN LAS MISMAS COMUNAS:

LA GENTE ES ZOMBI: HACE LO QUE HACE SIMPLEMENTE PORQUE ES LO QUE «SE» HACE.

SIN SABER POR QUÉ.

ESTÁN ENFERMOS ANTES DE ENFERMAR.

IMPORTARON LA PESTE Y CONTAGIARON A SUS NANAS Y JARDINEROS.

LUEGO ELLOS LLEVARON A LOS BARRIOS POBRES.

¿POR QUÉ PITÉATE A UN FLAITE Y NO PITÉATE UN CUICO?

LA ADORACIÓN AL DINERO HACE QUE QUIENES LOS POSEAN SEAN ADORADOS COMO DIOSES.

UNA SOCIEDAD ASÍ ESTÁ EN DECADENCIA Y PRONTA A DEJAR DE EXISTIR.

DEJARÉ DE ESCRIBIR POR UNA SEMANA. DEBO TENER TIEMPO PARA TERMINAR MI LIBRO.

TAL VEZ PUBLIQUE ALGO MAÑANA. MUCHAS GRACIAS.

ODA A LA DISCONTINUIDAD

ODA A LA DISCONTINUIDAD

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Este artículo resultó ser el spin off de aquella Obra Maestra llamada:

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¡Juraba de guata que lo había incluido en al Sagrada Trinidad de la K-POP intelectual!

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CITEMOS AL BANQUILLO AL MUCHACHO

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https://www.elconfidencial.com/alma-corazon-vida/2014-06-10/el-filosofo-de-moda-explica-por-que-eros-agoniza-y-el-pensamiento-llega-a-su-final_143996/

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La única observación que tengo para regalarle al Filósofo K-pop es (nótese como es 1 NACIÓN VERDADERA: NOs vende sus productos, ¡pero nos compramos su Kultura! Una Nación siempre tiene un único objetivo: Conquistar el Mundo y la única Nación que cumple esa definición HOY es Korea. Japón lo intentó con el animé y el Zen, pero fracasó. Joligud es lo único que mantiene en pie a la República Imperial de Roma de Norte América): Byung-Chul padece el mismo error que la Escuela de Frankfort, planteado en el ensayo de Walter Benjamin, acerca de la muerte del ARte por su reproductibilidad técnica.

NO es la Reproductibilidad técnica la que mató al Arte, sino que el cambio de Mentalidad, ¡de toda 1 Civilización!, que considera Ética dicha reproductibilidad. Antes se creía 1 Sacrilegio el sólo hecho de hacer imágenes.

Es decir: El Arte había sido asesinado, despojado de su “aura sagrada”, mucho antes de ser posible su reproducción facsimilar. De hecho, El Arte es lo primero y lo último donde se verifica La Definición de Modernización como Desacralización del Ordo Religioso Antiguo-Medieval.

Nótese como dicha Desacralización comienza con el retrato de la Familia Arnolfini, ya que ocupa el Modelo de la Sagrada Familia, lleno de símbolos sacros y místicos, para retratar una familia burguesa. Por eso que ese retrato se realiza en Flanders, perdón, Flandes y NO en Italia. Ese proceso Desacralizador culmina con la utilización de la forma Gospel por parte de Ray Charles, como arquitectura de sus canciones más famosas. Hecho por el cual fue repudiado en su momento.

¡Es más! La reproductibilidad técnica del Arte, tanto pictórico como musical, cuando se verifica, se plantea y es vista como un acto sagrado en sí mismo, por su comparación con la multiplicación de panes, peces y, sobre todo, el vino hecho por el Izquierdista Perfecto: Jesús el Nazareno, es decir, el que había prometido NO cortarse el pelo antes de la llegada del Mesías. ¡Ojo con esa contradicción! Si él se sabía El Mesías, NO podría llevar el pelo largo. Si llevaba el pelo largo, ¡NO era el Mesías! Dejemos la Soteriología para otro día.

Sólo después de serle anulado su carácter Sacro, la Realidad misma es susceptible de ser Explotada, Transformada y Reproducida, para ser vendida o alquilada, como el porno, porque se ha levantado la Pena, el Castigo Divino de romper los límites. ¡Ya NO hay querubines con espadas llameantes impidéndote comer 1 manzana, 1 niño, 1 niña o lo que sea! ¡El Mundo es infinito! ¡Puedes hacer lo que te plazca con él! ¡Puedes Crecer Económicamente de manera indefinida sin Castigo Divino alguno! Es más, Dios está de tu parte y te invita a: CRECED Y DOMINAD. ¡Qué buena onda este Dios patriarcal! ¿ONOFRE?

El Mundo, es decir, el Universo de lo Posible, Deseable, Realizable se ha vuelto infinito. Antes el Universo era finito, la esfera de Parménides, el Duoverso aristotélico, el geocentrismo, fuertemente defendido por la Iglesia Católica, es un Cosmos finito: ¡El Edén es un Jardín amurallado! De ahí que el atrevimiento de Giordano Bruno de declarar la Emancipación de los Límites, al refundarlo INFINITO, sea interpretado por la curia romana como romperlo en infinitos pedazos y, con ello, derribar el Sagrado Orden de las castas sacerdotales-sociales.

¿Por qué digo esto? Porque abrir, de par en par, las puertas a la Modernidad “clásica”, la “dura”, en el decir del polaco-inglés Bawman, significó primero y antes que todo: una Re-evolución mental. ¡Dense cuenta, iletrados incultos, que, entre la muerte de Giordano Bruno: EL Héroe Revolucionario y la toma de La Bastilla, tuvieron que pasar 189 años! Si hemos de creer que el 18 octubre es El Momento Refundacional. Sólo en el 2108 veremos concretados los ideales enarbolados hoy: Limitar la actividad económica a lo que realmente pueda ser SUSTENTADO por un planeta ¡FINITO! ¡Por amor a la Gran Diosa!

Mi Diosa: ¿Por qué me enviaste a esta Humanidad iletrada e inculta en grado sumo? Perdona mi falta de respeto y libérame de este sufrimiento.

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RETOMO:

Como dijo el Viejo Pepe: Al hombre Moderno la idea de la infinitud lo inflama de pasión, hasta ser capaz de morir por esa idea y cita al Gran Giordano. Pero en cambio, nosotros habitamos La Modernidad helenística, como la llamo. Esta tercera etapa es el final de la Modernidad, porque si bien la idea de infinito permanece en el imaginario colectivo, las investigaciones científicas nacidas en el seno mismo del paradigma moderno, retornar a la Finitud como Modelo Cosmológico.

La revelación científica de los Reales límites de Todo, es aún más desolador que el infinitismo a los ojos de los contemporáneos de Giordano Bruno: NO podemos matar a nadie y enterrar la cabeza en el oscurantismo de Kast, Bolsonaro y Trump. La misma teoría que afirma la Finitud del Todo, permitió el celular por el que chateas con tu gente y el posicionamiento GPS, entre otras maravillas helenísticas.

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PRIMERA LEY HELENÍSTICA:

El Big Bang demuestra que tiene un límite temporal y, por lo tanto, espacial: El Niverso NO es Eterno.

Tal como dijo el Viejo Pepe: Viniendo de una Edad en que se SENTÍA al Universo como Infinito, esta nueva finitud nos caerá como la amputación de un miembro virtual que nos sostenía en el optimismo ingenuo de eternas oportunidades y riquezas infinitas, abiertas de piernas para ser depredadas.

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SEGUNDA LEY HELENÍSTICA:

La Energía Oscura nos demuestra que tienes tus días contados en la disolución.

La única diferencia es que el Niverso tiene tal cantidad de días por delante, hasta su Fin que son incontables. Pero, tal como las promesas del Diablo, por muy GRANDE que sea, tanto en Tiempo como Espacio: ¡Es Finito! Lamentablemente, la Gran Diosa hizo un Niverso con letra chica.

Cosa que ya nos advertía El Viejo Pepe en su opúsculo: Interpretación Histórica de la Teoría de Einstein.

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TERCERA LEY HELENÍSTICA:

El Viejo Pepe, siguiendo su inveterada costumbre de hacer pasar ideas de otros por suyas, ¡te pillé chanchito!, rehusó llamar De la Relatividad a la Teoría de Einstein, porque, siguiendo a Plank (al que le roba la idea, porque NO nombra), afirmó que Einstein había dado con Lo Absoluto: La Velocidad de la Luz, descubriendo el nuevo metron, patrón de medida del Niverso.

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PARA HACERLA CORTA:

El Eros NO está agónico por su reproductibilidad técnica, el porno, sino que es susceptible de ser “pornificado”, porque antes se anuló su carácter sagrado, que es, precisamente, lo propio del patriarcado y que es el centro del debate en el Libro PLACER SAGRADO, que conmino imperativamente leer de inmediato, apenas termines de leer mis impertinentes palabras, que sólo te han estorbado su lectura. Así se verifica el Eterno Retorno a la Obra Maestra de la cual esta es sólo su corolario.

Sólo después de leerlo, tu vida recobrará su VERDADERO y SAGRADO Zentido. Un poemirijiYA de regalo, para el viaje:

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EL IMPERATIVO DE ELEGIR CADA SEGUNDO DE TU VIDA.

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BUSCANDO AMOR, NO TUVE SEXO.

BUSCANDO SEXO, NO TUVE AMOR.

NADA ES TOTAL EN ESTA GAIA.

JAMÁS OBTENDRÁS LO QUE QUIERES.

ACEPTAR LA MEDIOCRIDAD DE LA VIDA

ES EL MÁS DURO DE LOS APRENDIZAJES.

SIEMPRE TENDRÁS QUE DECIDIR QUÉ MIEMBRO AMPUTAR.

LOGRAR SUMA CERO ES A LO MÁS QUE PUEDES ASPIRAR.

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Que un animé desarrolle un arcano concepto helénico humilla a Occidente. Para mi Yuri.

Buenas NOches y BUEN ÁGAPE. EL OTRO ASPECTO DEL AMOR

a todi (traducción del helénico paanta).

NO son 30 pesos, sino el Regreso al Neolítico.

NO son 30 pesos, sino el Regreso al Neolítico.

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Tercera Lección de MetaHistoria

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“Never compromise. Not even in the face of Armageddon”.

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Como dije en la primera lección: NO es lo mismo MetaHistoria que, ¡métale historia!

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En una anterior columna, que olvidé cuál es, hablo que todos los movimientos sociales involucrados en el Estallido lo único que quieren es Volver al Pasado. La única diferencia es cuánto tiempo en el pasado proponen regresar.

La derecha 40 años, regresar a su Dictadura, cuando todo el poder era suyo.

La oposición: Antes de 1973, cuando mandaban y hacían Historia.

El Feminismo: Volver a las sociedades agroalfafrfat matricia

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Ese constructo socio-histórico que conocemos como Chile, camina muerto. CHILE NO SE VA A REFUNDAR. Lo que saldrá al final es otra cosa: Seguir llamándolo Chile es cagarse al crío de la Viuda.

Eso de bautizar a la cría con un nombre inapropiado es una Tragedia. Nací el 21 de Mayo, mi abuelo, místico-visionario, les dijo a mis padres que me bautizaran Arturo. Pero mi padre impuso el suyo.

Ojo para todas las mujeres que estén por parir. Ustedes son la encarnación de esa viudez y un mal nombre, caga la vida de sus hijos. Se los digo por experiencia. Siempre he sido Enrique, el chico. Mi padre, amorosamente siempre me ha dicho Kanito. ¿De qué me sirve que me cambie el nombre ahora, cuando mi vida está por terminar? Así de ridículo es plantearse la “Refundación de Chile”. ¡Al carajo Chile y todos los chilenos! Valen callampa.

Por diversas tragedias domésticas, el 15 de octubre de 2020 llegué tarde al Seminario, gracias al rescate de mi querido padre (reconocido como el Tesla chileno, por el medio Chile Okulto) y sólo vi los 5 últimos minutos de la ponencia de papas con Mayo. Así que me perdí el planteamiento del problema y la tesis del Albertío. Ahora me ha sido revelada la causa subyacente por la que NO llegué a tiempo ese día y estuve mal durante todo el Seminario.

Ahorakí, que vuelvo a verlo, me critico severamente: ¿Por qué no dije esto, lo otro y esto otro? Realmente estuve, cuando más, al 50% de mis capacidades. NO lo podía entender, hasta hoy, que ví la fundamentación de la pregunta: El Destino elige los actores para los papeles y yo NO fui elegido.

Es triste saberse rechazado desde antes del comienzo. ¡Es Verdad que Todo se decide antes de nacer! El Tiempo y el Espacio NO son irrelevantes: Lo deciden todo. El momento, el país, la familia en que se nace, modelan tu vida sin que puedas hacer nada para modificarlo. Como Shackelton, queriendo ir al Norte, estamos parados sobre un inmenso iceberg que va al Sur. Cuando nos damos cuenta, es demasiado tarde para hacer nada.

Verlo ahí, tranquilamente exponiendo las causas del Hundimiento de todas las Civilizaciones, me impactó como sólo aquella charla de Maturana en 1991 lo había hecho antes, pero en 1 Zentido totalmente contario a aquella: Torpedo en la línea de flotación. Maturana me hizo levantarme de la silla furioso y tomando como misión de vida refutar sus herejías. Eso me llevó a estudiar aún más, costándome la sanidad mental, la carrera y el respeto de mi padre.

Lo de hoy, 23 de octubre de 2020 es todo lo contrario. Si el primero me inflamó de deseo y ganas, el segundo me hizo ver que estoy en el catafalco y que cuando el cura termine el responso, me tirarán la paletada de tierra: NO insistas. Nunca fuiste parte de la Obra. Sinestesia. Imagino la voz de Mayol diciendo esta sentencia, con sus típicos tics. Desolación.

(imagen de las preguntas temporales)

Por más que uno quiera, el reparto fue decidido antes de nacer. El Destino es inapelable. La Vida es, esencialmente, La Injusticia metafísica. A unos pocos sí, al 99% ¡NICA! Lo peor, racionalmente injusto. Hay buenas razones para que sea Mayol y NO yo quien esté al frente de la pantalla. Carezco de la paciencia para ser profesor. Como bien dijo María Cecilia: Soy el borrachito que estrella el F16 al final del Día de la Independencia. Se los advertí hace décadas, pero nunca nadie me hizo caso, porque soy un puto NN.

Asumiendo la Realidad

En fin, después de asumir la triste realidad de ser el bot facho, según Izkia, el carabibueno, como me bautizaron en el chat de la MAFIA (NO se llama Cosa Nostra de chiste, ¡lo es en serio!), esta es mi respuesta a la pregunta de papas con Mayo y Cía.:

Tesis Ph.D. Filosófica-Epistemológica-Histórica Fundadora de La Transversalidad

NO HAY SISTEMA CAPAZ DE VENCER AL TIEMPO. Por ENTROPÍA y DETERIORO por ONDAS ARMÓNICAS y/o RADICALES LIBRES, SIEMPRE HA DE CAER EN LA NADA. Acostúmbrense al CARPE DIEM la Filosofía de todas las Decadencias.

Si nombro a Roma y su spin off, Bizancio, es tan sólo porque son Estructuras Sociales completamente conocidas por todos, pero la Decadencia es Universal e ineluctable. El Universo NO terminará colapsando sobre sí en un Big Crunch, que sería el Mito del Eterno Retorno (Eliade) llevada a la Cosmología, sino que simplemente se diluirá, obra de la Energía Oscura. NO tomar consciencia de ello es tan sólo el típico autoengaño de los ideoteues, como los llamábamos en Atenas. Esas dos realidades sociales, como todas las anteriores, incluso las fliliales y matriarcales, simplemente decayeron, presa de sus contradicciones internas.

Las organizaciones sociales son organizaciones vivas y, por lo tanto, lo obvio es que nacen, viven, dejan guachos por ahí, y mueren, dejando el coral marino, las estructuras que crearon para vivir y terminaron por asfixiarlos. Recordemos al Gran Arquitecto: NO es el hombre para el Sabatth, sino que el Sabatth es para el hombre. ¿ONOFRE? Como filósofo, subrayo la preeminencia del Ser, aún en el NO-Ser.

Lo que ahora muere NO-es simplemente un Modelo, es decir, una Modalidad de Ser Moderno, como lo fue el Imperio español, basado en la religión patriarcal de moda y Primera Ola Globalizadora Moderna, porque Alejandro fue la primera Antigua y Roma la segunda, dicho sea de paso; ó, como el británico (Segunda Ola Moderna, que creyó que el error del español fue la pesada carga ideológica de establecerse como adalid de una religión, por lo que reemplazo el Dogma Católico, por el Dogma de la Compañía de las Indias Orientales, tan sangriento como el anterior, tesis de Toynbee), sino que asistimos al entierro del Marco Conceptual mismo que da origen a la Civilización Occidental Moderna en su Totalidad: El Nominalismo. La tesis de Morris Berman.

¡NO es Descartes el Padre de la Modernidad! Bueno, podría serlo, siempre y cuando admitas que es Ockham el abuelo de ella, ya que inspiró a los Bacon (todo queda entre ingleses, es la tesis), a los cuales contesta Descartes y les ganó y quedamos todos como amiguis.

Lo que llamamos Chile tan sólo es “la provincia del Fin del Mundo” de la Edad Moderna, paladéese el juego semántico. Así que es imposible escapar del Hundimiento de la Civilización occidental Moderna en su Totalidad, como a una plancha de acero le fue imposible escapar del hundimiento del Titanic. Tan sólo somos un caso dentro del marasmo total de dicha Civilización.

Es cierto, siempre hemos sido la alucinación de algún iluminado. Eso revela la importancia de los primeros actos en TODO. Valdivia llega a Chile creyendo que es el pasillo para llegar a las antípodas y ahí forrarse con oro y otros tesoros jamás vistos. Ese es el Mito Fundacional nos ha perseguido toda la Historia. De ahí viene el sueño republicano de los independentistas, aplastado por Portales y Cía. Luego vuelto a aplastar en 1891, pero heredamos el MOP. A medias conseguido por Aguirre Cerda y heredamos la CORFO. Sepultado definitivamente en 1973, pero heredamos CODELCO y el litro de leche. ¿Qué heredaremos de estos 47 años, que coinciden, tristemente con los de mi mutilada vida?

Deja de creer en la excepcionalidad chilena. ¡Nunca estuvo dentro del Destino llamado Chile el ser Desarrollados! Sólo cambiamos de capital imperial: Madrid, Londres (de ahí la ineptitud del gesto huidobriano de su Finnis Britania), luego Wasihngton DC (odio esa sigla. ¡Me aparece hasta en los cómics!), y para finalizar, Beijing. Si algo hemos sido EN LA REALIDAD, NO la ficción alucinatoria de vendedores de humos de todos los tata colores, es esta: ¡Somos los putos Fenicios de TODOS los imperios mundiales!

De la misma manera que, cuando oí a los 2 reefers de mi iniciático viaje en barco, con los que exploré un granito del Viejo Mundo, decir: “¿Qué le va a hacer una cacha más a una puta vieja?”; 27 años después, me volvió a paralizar por completo, esa misma frase proferida por 3 subcontratados ebrios durante una de las ruidosas fiestas realizadas en la casa frente a donde vivo. Entonces me percaté de algo que les parecerá obvio, pero como NO soy obrero, sino Filósofo, para mí nada es obvio, hasta demostrar lo contrario: Esa frase NO era una ocurrencia de aquellos hombres ilustrados. Esa oración era la expresión de una Sensación Vital Transversal a Todo un Pueblo. ¿Qué puede esperarse de un pueblo en que aún sus machos recios se SABEN PUTAS? Soy un puto Filósofo.

Ambos eran egresados de prestigiosas universidades como ingenieros en refrigeración y teníamos diálogos en los cuales aprendí algo de física y epistemología y ellos algo de historia y filosofía.

Deja de alucinar con que Chile es especial y tiene una suerte de “Destino Manifiesto”: Ser los Pinky y Cerebro de Todos los experimentos sociales. Esa es la Alucinación Valdiviana que constituye el Mito Fundacional de este constructo social picante. Recuerdo cuando mi madre decía el lema de la vieja aristocracia: Lo picante es para los picantes. No más pruebas, su señoría.

TESIS DOCTORAL.

Todo constructo es artificial, un artificio, puede ser hecho y deshecho a Voluntad. Es la emocionalidad, a través del apego, el que le da a esa entelequia una virtualidad de solidez.

El hecho de que jamás se hayan cumplido las promesas hechas hacia mí, ha cortado dicho apego, por lo que, a pesar de vivir EN Chile, NO me considero chileno. Me da lo mismo lo que suceda y todo lo que ha pasado desde 2006 en adelante lo he vivido como la procesión de un Funeral. Me siento tanatólogo de una Era. Ese ha sido el Destino mi inexistencia potencial que el SarsCov2 puede hacer actual en cualquier momento.

Chile ya dejó de existir, pero la gente se empeña en creer que sigue vivo, como el paramédico que sigue presionando el pecho de una persona, a pesar que los especialistas le dicen que pare, porque ya está muerta. La gente en Plaza Dignidad está desbordada de emoción, porque cree que puede resucitar un muerto. ¿Qué va a pasar cuando la Triste Realidad los abofetée demostrándole la imposibilidad de ello?

De esto me di cuenta en 2006, cuando comprobé las ideas del Viejo Pepe y Pepe, El Joven, al tiempo que entraba en contacto con las de Guy: Las Revoluciones, lejos de ser las destructoras de las sociedades, son el itento por abrirlas a la Emergencia de lo Nuevo, pero esa sola imagen: Tener que aceptar en la misma mesa a los rotos (porque TODO sistema, para constituirse como tal, necesita sine qua non, excluir algo y a las encarnaciones de ese algo, llámese etnia o clase social), es repulsiva en grado sumo, por lo que se desata la pulsión suicida: ¡ANTES MUERTO QUE ACEPTAR A ESOS CULIADOS EN LA MESA!

Esta NO será la ocasión de romper la tradición humana del suicidio colectivo, tal como mencioné en mi anterior columna. ¿Acaso los chilenos se creen mejores que esas dos civilizaciones creadoras de los Fundamentos de la actual? En Chile NO hay equivalentes ni a Platón, Aristóteles, Plotino, San Agustín ni Santo Tomás u Ockham. https://es.wikipedia.org/wiki/Guillermo_de_Ockham

TESIS MAGISTER.

NO EXISTEN LAS TRANSICIONES. NO hay tal cosa como la llamada Edad Media, sólo hay Edad Antigua y Edad Moderna. La Divisoria de Aguas tiene nombre y apellido: SAN FRANCISCO DE ASÍS.

Guillermo extrapoló la vivencia radical (mística) de San Francisco al ámbito de la Razón: La Zencillez y el contacto Directo con la Divinidad (Realidad). De ahí que su famosa navaja, que a él le disgusta que la llamen así, sea la base de la ciencia moderna. Lo que me sirve como demostración de mi Tesis histórica, que nunca pude hacer, porque NO estaba en mi Destino ser académico: El origen de la siguiente Edad, está en el corazón de la anterior. Tome razón de ella la Concertación.

La Edad Moderna comienza, espiritualmente con San Francisco y viene a cobrar forma, porque eso es la Mente, tal como nos dice El Buddha, con Guillermo. De ahí en adelante, TODO, absolutamente todo es la lucha de este germen, lo propio de la Edad Moderna, contra el Aristotelismo-Tomismo. Cuando gana, ya estamos rumbo a otra era, que es lo que estamos viviendo. El Nuevo Germen también tiene nombre y apellido: https://es.wikipedia.org/wiki/Johann_Jakob_Bachofen

¡Ah, los pillé chanchitos! Todos creían que iba a nombrar al pirata intelectual de Maturana, pero resulta que todo intelectual demasiado famoso para pasar piola, lo es porque roba descaradamente y nadie lo puede pillar porque le robó a un muerto, de manera que se hace irrastreable esa apropiación fraudulenta. El Berto también le robó a Nietzsche su segunda Ley de la Biología. Gracias a este cabro, Mayol, me di cuenta que es sólo una generalización de un enunciado del sifilítico Federico. Presiento que las Ménades volverán a destrozar a Orfeo. En fin. La Byddha es 1 tragedia, si NO es Trágica, NO es BYDDHA, sino vidita zoológica.

¡Tanto luchar, para tener que dejar de lado la bandera por la cual se derramó tanta sangre, apenas llegados a la Cima del Poder! Y tener que dejar la cima del Poder, dicho sea de paso… Pero esto me suena a mito Greco Romano: ¡Sísifo, viejo amigo! Hacía tiempo que NO te veía tan contento.

El Viejo Pepe dijo que Chile era el país Sísifo, porque en 1925 sintió un temblor, que lo hizo arrancar de vuelta a la tranquila Baires.

PARA IR TERMINANDO.

Volveremos al Neolítoco, pero NO por proyecto político, sino por dictado solar:

https://ciencia.nasa.gov/ciencias-especiales/23jul_superstorm

¿Qué estaba haciendo el 18 de octubre?

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ACLARACIONES A MI PARTICIPACIÓN EN EL SEMINARIO.

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https://www.latercera.com/pulso/noticia/el-impacto-de-la-entrada-de-izkia-siches-al-conflicto-entre-la-clinica-las-condes-y-su-cuerpo-medico/LUC6AVAJ3NGOFHVE5M2BWWTL4Q/

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Yo la comparé con Bachelet, pero si leen mis publicaciones se darán cuenta que NO soy 1 troll facho ni un carabibueno, como dicen muchos de los miembros de la Mafia en el chat de wasap. Como digo: NO soy rojo, soy ultravioleta. Estoy más allá de la caja desde los 12 años. Mi mente está en la frontera entre el Niverso en expansión en las entrañas de La Nada. Cada momento es un orgasmo. Tan sólo pienso que u Líder que NO se moja el potito

Si comparé a Izkia con Bachelet es a raíz de esta investigación, que se la envié a ella, sin recibir respuesta alguna suya, ¡ni siquiera acuso de recibo! Tal como ella acusa a la Clínica Las Condes de NO responder las suyas: https://importanciadevivir.com/actualizacion-sarscov2-mayo2020/

Nunca oí o leí que ella llamase a modificar el protocolo sanitario-hospitalario acerca del SarsCov2. Supe de muchos contagiados de SarsCov2 a los cuales después de ser diagnosticados con PCR, los hospitales los enviaban a su hogar sólo con una tira de parecetamol, lo cual es, cuando menos, insuficiente, como plantea esa investigación, que me costó la sanidad mental y corporal.

Esa es la razón por la cual se encontraron muchos cadáveres en sus casas, departamentos o residencias, sólo por el mal olor de sus cadáveres o denuncias de los vecinos de NO haberlos visto salir en mucho tiempo. Esa situación podría haberse evitado si el protocolo propuesto en dicha investigación se hubiese hecho público. El oscurantismo en los mass media acerca de esta información es total y a nadie he visto que diga ni una de las afirmaciones contenidas en esa investigación.

A Todos los que han sido partícipes del ocultamiento de esta información, desde la reescritura de la nota periodística, de aquel medio regional donde aparecía el primer muerto covid: 1 asmático que iba rumbo de Aysén a Coyaique los acuso de ser CÓMPLICES PASIVOS DE LOS 30.000 MUERTOS. ASÍ DE ESTRUENDOSA Y ROTUNDA ES LA VERDAD, papas con Mayo.

Somos el 5° país con más muertos per cápita. ¡Chile se está muriendo y Nadie dice Nada! Eso desgarra mi conrazón cada día que me regalan. ¿Para qué, si todo es una tortura? Triste privilegio de sobrevivir mientras miles mueren, ¡pudiendo ser salvados con aspirinas y prednisona!

Si el virus me contagia, lo más probable es que muera asfixiado, con mis pulmones destrozados. Saberse con una espada de Damocles, cada vez que se sale a la calle, es la Nueva Normalidad. La Consciencia de saber que salir a la calle te puede matar, es un nivel de estrés que enferma. EL SarsCov2 mata, aún sin contagiar, porque ese estrés empeora tanto enfermedades físicas, como mentales. Chile es un país aún más enfermo que antes. Los femicidios continúan y aumentarán. ¿De qué les sirvió “regresar a la Democracia” a las Asesinadas? Eran asesinadas en Dictadura y en Democracia, porque ambas tan sólo son los dos lados del Sistema Patriarcal.

Conste que después de esa crítica, NO insistí en el tema, para NO arruinarle la presentación a Doña Izkia y me retiré del Seminario, apagando mi pantalla. Lo cual estuvo muy MAL, porque llega 1 minuto en que

ella llega a la misma conclusión que yo. Cito textual e invito a ver los 5 minutos anteriores, que argumentan una conclusión de Zentido Komún:

…y avanzar en una propuesta mala, ya lo hemos conocido en nuestro país, puede frenar avances muy necesarios que han sido postergados por más de… casi 30 años. Llevan, alrededor de 13 comisiones para reformar las Isapres. Todavía NO se logra y creo que hoy díia hay una ventana de oportunidad que NO podemos desaprovechar.

Esa misma idea vengo diciendo desde el año pasado, pero aplicada a la mala propuesta llamada CONVENCIÓN CONSTITUCIONAL, sí va a frenar una Verdadera Solución, como vengo diciendo desde el día siguiente a la firma del Pacto por la Paz. El dispositivo social Plebiscito-Convención Castrada es la trampa que nos condenará a otros 30 años de debates inconducentes, como los 30 años ya transcurridos y en los que ha habido 13 comisiones para reforma de las ISAPRES, absolutamente inútiles, porque nunca “era el momento ideal” para reformarlas, como la misma Izkia señala. ¡Fíjense: Reformarlas, ni siquiera abolirlas que es lo zensato! ¿Se dan cuenta por qué digo que es blanda?

Cuando dijo: NUEVOS LIDERAZGOS. Casi vomito, porque es la misma idea detrás de Fachelet. La ironía del tiempo viudo es la siguiente: NO se puede cambiar una sociedad patriarcal actuando matrízticamente. Por eso que el único medio para que los políticos “pesquen” a la gente es que ésta salga a la calle

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Esta es la razón por la cual lo de Avanzar con Rapidez, reformulación de Avanzar sin Transar es crucial: NO tenemos tiempo. La Gran Depresión 2.0 se nos viene el próximo año y va a causar miles de muertes por la carencia de todo tipo de cosas, que nos dejará aún más vulnerables:

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Trivia del Alumno respondón:

Al día siguiente sería bloqueada mi capacidad de escribir en el chat, incluso, mi imagen en pantalla. NO lo quise decir en ese momento, porque entendí que mi participación en el Seminario estaba comprometida por mi punto de vista. Sólo porque los asistentes mismos se dieron cuenta, entonces lo revelé y me fue levantada la Censura.

Se llama Cosa Nostra y NO es broma. Criticar al Poder siempre trae consecuencias, aunque sea un poder chiquitito. Aunque esa consecuencia sea que NO puedes escribir en el chat o tu pantalla esté en negro. Siempre he odiado al Poder. Siempre he amado el Caos. Sólo seré Feliz cuando todo esto se vaya al carajo. Soy el único que puede salvarlos, como dijo María Cecilia, la Sabia.

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LA ÉTICA DEL RESPONDÓN:

Para los que NO sepan de dónde saqué el epígrafe de este artículo, aquí La Fuente:

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Coda.

Como dije más arriba, el feminismo quiere regresarnos el Neolítico con su Diosa Magna Mater y Serpens , pero NO tienen el Poder necesario para ello, porque ellas están divididas. Así esa función la cumplirá el Xol:

https://ciencia.nasa.gov/ciencias-especiales/23jul_superstorm

Buenas noches a todi. Voy a dormir han sido 36 horas agotadoras.

Los equipos occidentales fueron eliminados del Mundial de Liga de Leyendas, lo cual es muy triste: Occidente decadente. Pero Sookie sigue siendo muy hermosa:

Roma NO se refundó, Bizancio NO se refundó.

Roma NO se refundó, Bizancio NO se refundó.

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¿Por qué Chile debería ser la excepción?

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Vaticino que antes que esa supuesta refundación, llegará la EMC

y nos llevará de vuelta al Paleolítico.

¡Nada que hacer, todo está perdido, disfruta tus últimos días!

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Film dedicado a los NOeslaformistas que razgan vestiduras por un semáforo destruido, cuando ellos destruyen El Palacio de LA Presidencia con la que tanto se llenan la boca.

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Como dije hace décadas: NINGUNA ESTRUCTURA SOCIAL PUEDE REFUNDARSE.

NI LOS PALEOLÍTICOS NI LOS NEOLÍTICOS PUDIERON HACERLO Y

TENÍAN MEJOR DISPOSICIÓN MENTAL-ESPIRITUAL.

AHORA SÓLO HAY IRA Y CONFUSIÓN:

LINDO CÓCTEL PA’ LA REFUNDACIÓN.

MIENTRAS ESTABA EN EL SEMINARIO…

MIENTRAS ESTABA EN EL SEMINARIO…

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ESTO OCURRÍA EN EL CIBER ESPACIO (es más entrete que varias exposiciones de él)

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Extracción recursos lunares yanquis sin Rusia ni China.

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Les diré lo que nadie dice acerca del DINERO: El Dogma central de todas las religiones llamadas Economía Política. ¿Por qué el Dinero es Poder? Porque ¡ES UNA ORDEN! NO tienes que pedir permiso para que estén obligados a pasarte algo o alguien para que haga o te brinde un servicio, como el nivel de los rosos. Tu pasas Dinero y te pasan el producto o servicio que sea. NO debes pedir permiso ni dar las gracias. Dinero=Dar órdenes=Poder. Desde el momento en que NECESITAS Dinero para comer, estás frito: Debes Obedecer y te conviertes en sirviente de otro. Esta íntima degradación la tiene muy clara el Pueblo, que se siente la PUTA del Amo, del Poder. Eso degrada e irrita. La Gente estaya, pero luego vuelve el típico: ¿PARA QUÉ VOTAR SI =TENDRÉ QUE IR A TRABAJAR? El Dinero manda, por lo tanto, a menos que seas un Santo o un Boddhisattwa, a quien le importa nada el mundo material, DECIDE tu vida otra persona, al colocar en tal o cual parte su dinero, porque le otorga a ese espacio, el Poder de decidir sobre el resto.

Como el dinero está en las INSTITUCIONES financieras, ahí está el Poder, ante el cual todos se inclinan genuflexos. El Levantamiento es siempre intenso, pero fugaz. A menos que el TENDRÉ QUE IR A TRABAJAR, se transforma en un, al Diablo con todo, YA NADA TENGO QUE PERDER y si ganamos, algo tendré. Todavía NO se ha llegado a ese límite. Cuando se llegue, NO hay vuelta atrás. Caerá la Civilización, a menos que haya un cambio muy rápido de esquema organizativo, lo cual es imposible.

La Rigidez que imposibilita el Cambio y la Fatalidad del que nada tiene que perder, porque ya perdió lo que era valioso, reaccionan violentamente y tenemos una Masacre o una Revolución. La irracionalidad se desata ante el fracaso de los racionales por acordar una cauce los suficientemente amplio “donde quepan todos o casi todos”.

Tal como demostró John Kenneth Gailbraith en su Genial Obra: El Nuevo Estado Industrial, demostró que NO 1 hay diferencia esencial entre comunismo y capitalismo, porque en su núcleo o nivel central de decisón, ambas son economías planificadas: El Complejo Militar-Industrial, como lo bautizó el general y Presidente Eisenhower. Eso era desde la 2GM hasta los ’90s, pero ahora La Gravedad del dinero fue desplazada a las finanzas, por lo que ahí se toman las decisiones de Estado. Ahora es El Complejo FED-Financiero, el que planifica la Economía y, mediante esa herramienta, la vida de miles de millones de personas, como nosotros, que somos menos que una estadística, donde nuestra escasez poblacional hace que pesemos menos que palomitas de máiz.

Si en Chile, la Ley de Pesca fue redactada en la oficina del gremio pesquero, en USA las leyes las dictan los grandes bancos. La principal exportación de USA es dinero, por lo tanto, su única empresa es la financiera. Hace dos décadas que dejaron de ser productores de algo. Ahora sólo producen déudas. Bonos del Tesoro, préstamos del FMI, emisión de dólares de la FED, billones de dólares imposibles de pagar. La FED oculta eso con su emisión de 100.000 millones todas las semanas. ¡Suma! De esa manera la gente tonta cree que esa deuda puede ser pagada, algún día. Lo Real es que NO la pagarán. ¿Qué pasará cuando la gente tonta se de cuenta de ello?

De partida, será demasiado tarde para hacer algo, porque todo el dinero se habrá esfumado en especulación. Sólo los avispados banqueros, sabrán cuándo retirar su dinero de la bolsa, bancos, bonos, etc. Serán los pequeños inversionistas los que perderán todo, arrastrándonos a otra Gran Depresión. El Estado, quebrado mucho antes, por darle dinero a los Grandes Capitalistas, hará patente su quiebra ante la imposibilidad de regalar dinero o que NO servirá de nada regalarlo, porque nada valdrá, por una hiperinflación a lo Weimar-Venezuela.

Mi extremo agotamiento, por meses de estrés constante y mala alimentación, por mi pobreza, me impiden seguir ahondando en este espinoso asunto de mentiras y crueldad universales.

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Lo único que puedo decir es que lo que aquí se afirma, yo ya lo había concluido en el mes de abril y lo dejé por escrito en mayo, dos días antes de mi cumpleaños, a modo de regalo a la Humanidad. Lo más impactante es cómo hicieron esa correlación como factor decisivo entre obesidad y muerte por SarsCov2 como la comorbilidad decisiva al respecto. Eso me sorprendió sobremanera. Lo que conversaron con el invitado sólo reforzó mi postura, a pesar de todos lo males del centralismo y el Estado, prefiero eso, a estar con miedo de morir todos los días. Esa seguridad bien vale la libertad. Por más que les duela a todos.

Si me asegura estar con mi amada y NO morir de manera tan horrorosa como es asfixiado, voto por eso, porque, lo más gracioso, es que al otro lado del océano, tampoco es un paraíso de libertades: Hablar contra Trump o USA, también es castigado. Y la manera en que USA trata a los emigrantes latinos es muy similar a como China trata a los uigures: Campos de detención, separación de familias, deportaciones o reeducaciones, es decir, USA y Occidente, en general, HAN HECHO ABSOLUTAMENTE NADA para ganar mi cariño y que quiera defenderlos de la invasión china. ¿Será que se repite la Historia de Ucrania durante la invasión nazi? Salieron a saludarlos como salvadores del régimen soviético, pero a los meses se dieron cuenta que era aún peores, demasiado tarde.

Eso es lo que me pasa con los gringos: NO son mejores que los chinos, porque se han robado el cobre y otros minerales gracias al DFL600 y nos regalaron el Golpe del 73. En ese sentido, los chinos han sido más sutiles: Compraron la parte canadiense de SQM.

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Tal como lo adelanté en otra publicación: NO SE PUEDE REFUNDAR UN SISTEMA. TODO SISTEMA PATRIARCAL SÓLO SABE AUTODETRUIRSE. La URSS NO podía dejar de hacer tanques; USA NO puede dejar de hacer deuda. La deuda es el agujero negro que traga sociedades, como sus homólogos celestes, se tragan soles: Poco a poco, pero sin descanso y cada vez más rápido, hasta que aún corriendo, NO puedes escapar. Jamy Daimon, Ponce Lerou y la ineficacia de las multas para corregir a criminales. Como dicen en Keiser Report: Las autoridades consideran que una cierta cantidad de fraude ES NECESARIO para mantener a flote la economía. Recuerdo Big Short, cuando el inversor les grita en la cara que el sistema es fraudulento y que el fraude NO conduce a nada, salvo la Caída del sistema.

https://independent.typepad.com/elindependent/2019/12/argentina-el-saqueo-como-forma-de-vida.html ¿Qué más puedo decir ante semejante elocuencia? Todos somos cómplices pasivos y unos cuantos lo son activos de la Debacle Ambiental-Económica-Humana.

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Geoinigeniería contra Recalentamiento planetario. ¿Es buena o mala? Viuda Tompkins dice que NO es la solución y que es demasiado tarde para frenarlo. ¿Por qué? Ella NO lo dice, pero eso yo lo sé desde 1995 cuando lo supe: La Inercia. Mientras más grande la masa desplazada, más costará frenar el movimiento de ese cuerpo. ¿Algo más grande que la Tierra?